高效液相色譜－質譜（HPLC-MS）聯用技術HPLC-MS簡稱LC-MS

HPLC-MS是近些年出現的聯用儀器，發展非常迅速，彌補了GC-MS只能測定揮發性或半揮發性物質的不足，使色譜－質譜聯用技術得到了完善。GC-MS由于接口技術技術難度相對較小，因此，開發使用較早，而HPLC－MS接口技術技術難度較大，開發使用較晚。

HPLC-MS所提供的信息與GC-MS相同（TIC、MC、SIM、全掃描三維圖等）。一、概述

HPLC-MS的特點：

MS作為LC的檢測器不僅能得到色譜數據，如：峰保留時間、峰高、峰面積等，同時亦可得到質譜信息。具體如下：1、質譜為通用性檢測器，可測定不帶生色團或熒光基團的化合物；2、質譜也是選擇性檢測器，用選擇離子檢測可一次完成定性、定量分析，且靈敏度很高。3、提高鑒別化合物的可信度；可準確分析色譜峰的純度；確定分子量。4、可分析不適合GC-MS分析的親水性強、熱不穩定及生物蛋白化合物。5、在線分析，免去了色譜組分的收集，減少樣品損失，縮短工作周期。6、適用范圍寬，正相、反相、離子對及手性色譜均可使用。7、采用碰撞誘導解離技術(CID)以及多極質譜等可提供豐富的化合物結構信息。由于HPLC目前的應用極其廣泛，特別是在我們藥學專業應用更為普遍，所以LC-MS在使用上比GC-MS有更高的使用價值。與GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。另外，LC-MS一般用來分析揮發性差，熱不穩定的樣品，應用范圍增大。非極性化合物不能分析。（難以離子化）VacuumSystemSampleInletDetectorDataSystemMassAnalyserIonisationMethodAtmosphere二、LC-MS的工作原理1.接口的重要性接口是HPLC與質量分析器之間的過渡裝置并承擔著離子化的任務。由于MS需在真空下操作，以便完成離子形成、分離、檢測的過程。但是HPLC出口含有大量的流動相（溶劑）（0.2～2mL/min）。大量的流動相不得進入MS

？HPLC的流動相處在高壓下，液體氣化成氣體，其膨脹系數約為1000倍以上。1mL流動相液體可氣化成1000mL氣體。流動相的去除是接口的主要任務之一。不如GC-MS接口成熟，歷史較短。

三、LC-MS的接口2.接口的種類（離子化方法）熱噴霧快原子轟擊（FAB）電噴霧(API-±EI、ESI)√大氣壓化學源(API-±CI、APCI)√大氣壓光電離源(APPI)粒子束①電噴霧電噴霧接口（ESI）工作原理:三個步驟：a、帶電液滴的形成；b、溶劑蒸發和液滴碎裂；c、離子蒸發形成氣態離子a、帶電液滴的形成色譜流出物經毛細管頂端噴出，形成扇狀噴霧，再3~8kV的高電場作用下，形成高度電離、含有溶劑的試樣微小液滴。b、溶劑蒸發和液滴碎裂液滴與干燥氣作用，在干燥氣的作用下，溶劑蒸發，離子向液滴表面移動，造成液滴表面的離子密度越來越大，當達到Rayleigh限時，液滴表面電荷產生的排斥力與液滴表面的張力大致相等，液滴非均勻破裂，分裂成更小的液滴，更小的液滴繼續重復蒸發、電荷過剩和液滴分裂的過程。電噴霧接口（ESI）工作原理:c、離子蒸發形成氣態離子當液滴分裂至小于10nm時，其表面形成的電場足夠強，電荷的排斥作用導致部分離子從液滴表面蒸發出來，最終以單電荷或多電荷離子形式從液滴中轉移至氣相，形成氣相離子。++++++++++-----++++++++++-----++++++--N2氣流干燥ChargedDroplets電噴霧接口（ESI）液滴變化示意圖:從毛細管噴出（在3～8kV電場作用下）氣態試樣離子++++++--氣態試樣離子試樣＋－+－+Rayleigh限<10nm參見備注以上過程是在大氣壓條件下進行的，在強電場驅使下，電離的溶質離子通過一個金屬毛細管進入真空區，并電場作用不斷加速聚焦進入質量分析器。ESI的垂直模式：電噴霧接口的特點:主要給出準分子離子信息，（例如[M+H]＋、[M+Na]＋、[M?H]?、[M?Na]?等），以及大量的多電荷離子，而較少給出化合物的碎片離子；常用于強極性化合物及高分子化合物的測定，一般不適于非極性或弱極性化合物的分析；由于溫度較低，因此較適用于熱不穩定化合物；只能允許非常小的液體流量（0.2~1mL）。②大氣壓化學源(API-±CI、APCI)大氣壓化學源工作原理

與ESI相似，所不同的是通過電暈放電針首先使溶劑離子化，離子化的溶劑與待分析物氣態分子發生離子交換反應，形成準分子離子，使分析物離子化。150℃[Sol+H]+＋M→[M＋H]+＋Sol（質子轉移）或[Sol+H]－＋M→[M＋H]－＋SolSol+＋M→M+＋Sol或Sol－＋MH→M－＋SH（質子抽出）

▲很少產生碎片，離子流集中在幾種離子形式（一般為準分子離子），所以靈敏度高。

▲信息量少。

▲適用于有一定揮發性的中等極性或弱極性的樣品，分子量2000以下。

▲允許使用流速高及含水量高的流動相；極易與RP－HPLC匹配。特點：1.接口的選擇四、

LC-MS分析條件的選擇和優化ESI和APCI是兩個最常用的接口，他們各自有優缺點但相互補充。ESI的優勢：適用于中等到強極性物質的測定；而弱極性或非極性物質無法測定；APCI的優勢：適用于弱極性物質的測定。也可分析非極性化合物，但靈敏度較低。（1）正離子模式由在溶液中能夠形成的離子極性決定離子的極化方式。如果在溶液中能夠形成的離子為正離子，如堿性物質，則離子化模式選擇為正離子模式。得到的準分子離子一般為[M+H]＋，其他也較常見的如[M+Na]＋、[M+NH4]＋、[M+Na+CH3OH]＋、[M+H+CH3OH]＋等。2.正負離子模式的選擇

正離子模式一般用乙酸（pH3~4）或甲酸（pH2~3）對樣品進行酸化，若樣品的pK值已知，pH至少低于pK值2個單位。（2）負離子方式如果在溶液中能夠形成的離子為負離子，如酸性物質，則離子化方式選擇為負離子方式。得到的準分子離子一般為[M－H]－。負離子模式可以用氨水或三乙胺對樣品進行堿化，pH至少高于樣品pK值2個單位。對于酸堿性不明確的物質，可以先使用APCI（+）模式進行預試。（1）種類：甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及易揮發鹽的緩沖溶液。3.流動相的種類及流量的選擇

若流動相需用緩沖溶液，該緩沖液最好具有揮發性，這樣可減少緩沖鹽在離子源內的沉積。

應當根據樣品所需的極性以及樣品的pH值，調節流動相的pH。蛋白酵素

流動相應當具有低的蒸發熱和低的表面張力，以增強離子的解吸作用，離子化效率提高。（2）流速：和色譜柱的內徑有關，內徑越小流量越小。內徑(mm)0.31.02.14.6流速(μl/min)1030~60200~500>700MSD與DAD的比較椰子油（椰子油）（三甘油）五、HPLC-MS的靈敏度氨基甲酸鹽六、LC-MS聯用儀的真空電噴霧是一種“軟”電離技術，通常只形成準分子離子，提供分子量信息。但是在實際工作中，特別是對未知化合物的分析，不僅需要分子量，而且更需要盡可能多的化合物碎片信息。碰撞誘導解離（CID）可解決這一不足。

這里所講的CID是指“源內CID，In-SourceCID”。七、

碰撞誘導解離（CID）技術參見備注惰性氣體沒有商業譜庫縮氨酸（TandemMassSpectrometry）由兩個以上的質量分析器串聯而成。簡稱串聯質譜。常見的為：三級四極桿質譜1.空間上的串聯質譜（tandem-in-space）八、多極質譜（串聯質譜）API4000三重四級桿質譜儀示意圖CID單四極桿與串連四極桿質譜對比串聯質譜基本功能：（各種掃描方式）（1）Q1全掃描（2）母離子（precursorion）掃描初始離子掃描（3）子離子（ProductIon）掃描（4）中性碎片丟失掃描（5）多重反應監測（MultipleReactionMonitoringMRM）各種掃描方式的原理解釋：Q1FullScan(Start–Stop)(Q1全掃描)Q1alwaysusedassingleMSanalyzerUsedprimarilyforident.ofprecursorionSIM-SelectedIonMonitoring

(選擇離子監測)UsedtooptimizeanalyzerforspecificionsSIMusedforquantitativeanalysesQ1SIMusedto“optimize”precursorionMaximizesignalinpreparationforMS/MS選擇離子監測：SIM用于檢測已知或目標化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數據采集的方式一般用于定量。若幾種目標化合物用同樣的數據采集方式監測，那么可以同時測定幾種離子.PrecursorIonScan(母離子掃描)Q1sweepsagivenmassrange,Q3isfixedUsedtodeterminethe“origin”ofparticularproduction(s)createdinthecollisioncellFrequentlyusedfordrugmetaboliteidentification(commonproductionobservedinthemetabolites)m3+fixedm1+scannedExampleofPrecursorIonSpectrum600900120015001800m/z,amu587.5745.6895.6802.4633.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z,amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity,cps608.3520.3802.4600900120015001800m/z,amu3.0e46.0e49.0e4Intensity,cpsPrecursorsionof86Q1Scan745.6母離子掃描的作用母離子分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。ProductIonScan(子離子掃描)Afteridentification,theprecursorionissentintothecollisioncellandfragmentedbyCIDQ1isfixed,Q3sweepsagivenmassrangeUsedforstructuralelucidation（結構確認）Firststeptodevelopingquantitativemethodm3+scannedm1+fixedExampleofProductIonSpectrumEphedrine（麻黃堿）,MW=165M+1中性丟失掃描中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，也可以幫助進行未知物結構判斷。例如：18-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。MultipleReactionMonitoring(MRM)多重反應監測PrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CID)Manyprecursortoproductionpairscanbemonitored(A-B,A’-B’,etc.)MRMisthebestwaytomaximizesignalintensityofproductionsMRMusedprimarilyforquantitationMRMforQuantitation?RetentionTimeIntensityRetenti