免疫標記技術節酶免疫技術第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十六章酶免疫技術第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.酶聯免疫吸附試驗的原理、方法類型、應用及注意事項。2.酶免疫分析技術的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術的基本原理及應用。本章要點第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日目錄

酶標志物的制備

1

酶聯免疫吸附試驗

2其他酶免疫技術

3第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日前言

酶免疫分析技術是以酶標記抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應的抗體或抗原。將抗原抗體反應的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結合的一種免疫檢測技術。第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節酶標志物的制備

一、常用的酶和底物標記酶的條件：

1.活性高，純度高2.作用專一性強3.性質穩定，易與抗原或抗體偶聯4.測定方法簡便易行、敏感、精確5.酶和底物對人體無害且價廉易得第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關輔基是酶的活性中心RZ值越大純度越高RZ值與酶活性無關，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應用最為廣泛的標記用酶

常用酶第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習慣上被稱為底物，底物有多種。H2O2為受氫體，不穩定，需在用前臨時配置。第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日OPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩定，致癌性。TMB反應后顯藍色，加酸終止反應后變為黃色,測定波長450nm，穩定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.堿性磷酸酶

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌中提取。ALP底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經AP作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、制備酶標記抗體(抗原）的方法制備酶標記物的方法應符合簡單、產量高，避免酶、抗體（抗原）、酶標記物各自形成聚合物，標記反應不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應性等原則。

主要方法：戊二醛交聯法

改良過碘酸鈉法

第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、酶標記物的純化與鑒定純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應用。常用的是凝膠層析法和硫酸銨鹽析法，硫酸銨鹽析法操作簡便。酶標記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標記率的測定

第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、固相載體（一）固相載體的要求①結合抗體或抗原的容量大；②與抗原或抗體結合穩定且不易脫落；③不影響所固定的抗體或抗原的活性；④固化方法應簡便、快速。

第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二節酶聯免疫吸附試驗一、ELISA的檢測原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對底物催化的顯色反應程度，對標本中抗原或抗體進行定性或定量。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、ELISA的方法類型（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的較大分子抗原的測定。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

E固相抗體標本（含抗原）酶標抗體EE底物第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日如果血清標本中含有類風濕因子（RF），則可出現假陽性反應。因為類風濕因子是一種抗變性IgG的自身抗體，它可同時與固相抗體和酶標抗體的Fc段發生結合，導致假陽性的出現。

第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）雙位點一步法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

EEE底物固相抗體標本（含抗原）酶標抗體第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日如果待檢標本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應（hookeffect）”。鉤狀效應嚴重時，可出現假陰性結果，必要時可將待檢標本適當稀釋后重新測定。第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體（亦稱為酶標二抗）來檢測已與固相結合的待測抗體。第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

固相抗原標本（含抗體）酶標二抗底物EEE第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日此法由于受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測標本進行一定稀釋后才能測定。第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日（四）競爭法競爭法既可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與待測抗原的量呈反比，待測抗原越多，其結合特異性抗體越多，而酶標抗原與特異性抗體結合就減少，底物顯色反應淺；顯色越深，待測抗原量則越少。競爭法測抗原第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日酶標抗原

EEEE固相抗體標本（含抗原）底物E第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日競爭法主要用于檢測小分子抗原，因小分子抗原只有一個抗原決定簇

。第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日競爭法檢測抗體HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區別。第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.競爭法檢測HBcAb：先將HBcAg包被在固相載體上，形成固相抗原，之后加入待測樣本和酶標的特異抗體，待測樣本的抗體將與酶標抗體競爭與固相載體上的特異抗原結合，溫育后洗滌，加入酶底物顯色，顯色的強弱與待測抗體的含量成反比

。第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日固相抗原標本（含抗體）底物酶標抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.競爭法檢測HBeAb：先將HBeAb包被在固相載體上，形成固相抗體，同時加入待測樣本和中和抗原HBeAg，待測樣本的抗體將與固相抗體競爭與中和抗原HBeAg結合。加入酶標的特異抗體，再加入酶底物，則顯色的強弱與待測樣本中的相應抗體的含量成反比。第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日固相抗體標本（含抗體）抗原酶標抗體EE底物E競爭法檢測HBeAb第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日

(五)捕獲法固相載體上連接的是IgM的第二抗體，先將標本中的IgM類抗體捕獲，然后再分別加入特異抗原和酶標抗體（動物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特異抗原-酶標抗體的復合物，復合物含量與待測IgM成正相關。最后加入底物，依據顯色程度來確定待測血清中IgM的含量。

第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日固相抗人lgM抗體E標本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測lgM抗體第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日在應用此法時需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結合，又能與隨后加入的酶標抗體結合，從而導致假陽性結果。第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日(六)雙抗原夾心法將已知抗原包被在固相載體上，待測標本中的相應抗體可分別與固相抗原和酶標抗原結合，形成固相抗原-抗體-酶標抗原的復合物，加入底物后依據顯色程度來確定待測抗體的含量。

第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日E固相抗原標本（含抗體）酶標抗原底物EE第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、ELISA的關鍵技術（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過程。封閉(blocking)就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。

3．酶標結合物的制備

第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）測定方法的標準化

1．加樣應力求準確，并注意不可產生氣泡。2．溫育注意反應的溫度和時間應按規定的要求，整塊反應板的溫度應一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機洗滌兩種方法，若用洗板機洗滌要適當增加洗滌次數。4．顯色要控制好顯色時間。第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、評價與應用

評價ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩定，對環境無污染，儀器、設備要求簡單，實驗結果既可以用肉眼觀察作定性分析，也可以用酶標儀進行定性、定量分析，已經成為臨床免疫檢驗中的常用技術。第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

應用1.病原微生物測定2.激素測定3.藥物測定4.腫瘤標志物5.蛋白質測定第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日第三節其他酶免疫技術一、均相酶免疫技術

（一）酶擴大免疫分析技術（二）克隆酶供體免疫分析第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日酶擴大免疫分析技術示意圖第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日克隆酶供體免疫分析示意圖第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

液相酶免疫技術是非均相酶免疫技術的方法類型之一，因抗原抗體反應在液相中進行而得名。其依據樣品抗原加樣順序和溫育反應時相不同可分為平衡法和非平衡法兩種類型。

二、液相酶免疫技術第四十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、斑點酶免疫吸附試驗屬于ELISA的一種類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質能力很強的硝酸纖維素膜（NC膜）代替了聚苯乙烯反應板來作為固相載體，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。

第四十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日第五十頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、斑點酶免疫滲濾試驗是將NC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗體，干燥后封閉，再依次加入待測標本、酶標抗體，最后加入底物，陽性時可在膜上出現有色斑點。

第五十一頁，