第3章蛋白質的通性、純化和表征生物化學.第一篇生物分子的結構和化學生物化學.第一篇生物分子的結構和化學本章主要內容一.蛋白質的酸堿性質二.蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀三.蛋白質分離純化的一般原則四.蛋白質的分離純化方法五.蛋白質相對分子量質量的測定六.蛋白質的含量測定與純度鑒定一、蛋白質的酸堿性質生物化學.第一篇生物分子的結構和化學第三章蛋白質的通性，純化和表征1.1蛋白質的兩性解離與等電點蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團從而使蛋白質帶電。蛋白質與氨基酸一樣具有兩性解離的性質，因而也具有特定的等電點。

蛋白質兩性解離pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白質等電點：對某一種蛋白質來說，在某一pH，它所帶的正電荷和負電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為蛋白質的等電點。蛋白質的等離子點：沒有其他鹽類干擾時，蛋白質質子供體基團解離出來的質子數與質子受體基團結合的質子數相等時的pH稱為等離子點。等離子點是每種蛋白質的一個特征常數。蛋白質的等電點和等離子點生物化學.第一篇生物分子的結構和化學第三章蛋白質的通性，純化和表征當溶液pH=pI時，蛋白質粒子凈電荷為零，在電場中不移動；當溶液pH＞pI時，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；當溶液pH＜pI時，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。1.2在不同的pH環境下，蛋白質的電學性質不同生物化學.第一篇生物分子的結構和化學第三章蛋白質的通性，純化和表征2.1.分散體系

一種物質以極小的顆粒（分散相）分散在另一種物質（分散介質）中所組成的體系。分散相質點半徑<1nm:真溶液分散相質點半徑介于1-100nm:膠體溶液分散相質點半徑>100nm:懸濁液分散系二、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀2.2膠體溶液保持穩定的條件：①分散相質點大小分子直徑在1-100nm范圍內，這種大小的質點在動力學上是穩定的。②分散相質點帶同種凈電荷，相互排斥，不易聚集成大顆粒而產生沉淀。③分散相質點能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層，相互間不易靠攏而聚集。+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉蛋白質分子相互聚集而從溶液中析出的現象稱為沉淀。Ⅰ可逆沉淀（非變性沉淀）：溫和條件，改變溶液pH或蛋白質所帶電荷蛋白質結構和性質沒有變化適當條件下可重新溶解例如：等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等2.4.蛋白質的沉淀

II.不可逆沉淀（變性沉淀）強烈沉淀條件破壞蛋白質膠體溶液穩定性也破壞蛋白質結構和性質沉淀不能再重新溶解如加熱沉淀、強酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等2.5.1鹽析定義：向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等]，以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從溶液中沉淀析出，稱為鹽析。作用機制:中和電荷的同時破壞水化膜。優點:鹽析沉淀蛋白質通常不會引起蛋白質的變性。2.5.蛋白質沉淀方法如:甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀可引起蛋白質變性

2.5.2有機溶劑沉淀法2.5.3重金屬鹽沉淀法當溶液的PH＞PI時，蛋白質顆粒帶負電荷，它容易與重金屬鹽（氯化高汞、硝酸銀、醋酸鉛等）中的重金屬離子（Hg2+、Cu2+、Ag2+）結合成不溶性鹽而沉淀。2.5.4生物堿試劑和某些酸類沉淀法pH小于等電時，蛋白質帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：單寧酸、苦味酸、鎢酸酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸和硝酸。原理調節兩性生化物質溶液的pH值，以達到某一生化物質的等電點，使其從溶液中沉淀析出而實現分離的技術稱為等電點沉析技術。2.5.5等電點沉淀法反應名稱試劑顏色反應有關基團有此反應的Pr或aa雙縮脲反應NaOH、CuSO2紫紅色二個以上肽鍵所有蛋白質米倫反應HgNO3、Hg(NO3)及HNO3、HNO2混合物紅色

Tyr黃色反應濃HNO3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應乙醛酸試劑沿管壁慢加濃H2SO4兩液層間出現紫色環

Trp坂口反應Sakaguch反應)α-萘酚、N