華中科技大學生命科學與技術學院生物物理與生物化學研究所陸婕 生物化學第34章

DNA的復制和修復生物多樣性生物穩定性DNA：生命的控制器.rm反中心法則中心法則DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDP第一節DNA復制的特點

DNA在復制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現象稱為DNA的半保留復制(semi-conservativereplication)。

一、半保留復制

1958年Meselson和Stahl的實驗首次有力地支持了半保留復制方式。實驗步驟：１.大腸桿菌放在15NH4C1培養基中生長15代２.再將細菌移到只含有14NH4C1的培養基中培養３.裂解細胞４.將裂解液放在CsC1溶液中進行密度梯度離心５.在紫外光下可以看到形成的區帶Bacterialculture15NH4Cl(SoleNsource)GrowforseveralgenerationsBacterialculturewithdenseDNAThisisthestartingmaterialfortheexperimentHarvestcellsandresuspendinmediawith14NH4Cl

asthesoleNsourceBacterialculturewithdenseDNAGrowfor1generationHarvestsomecells“1stgeneration”GrowforanothergenerationHarvestsomecells“2ndgeneration”GrowforanothergenerationetcBacterialculture“0generation”14NH4ClMeselsonandStahlOriginalData意義：遺傳穩定性遺傳過程相對保守性復制起點:

DNA復制在生物細胞中要從DNA分子上特定位置開始。這個特定的位置就稱為復制起點(Originofreplication)，用ori表示。

復制子:

DNA復制從起點開始雙向進行直到終點為止，每一個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元(replicon)。復制叉:

DNA復制的生長點形狀如同分叉故稱為復制叉。二、有一定的復制起始點用遺傳學和生物化學的方法可以確定大腸桿菌染色體DNA的復制起點在基因圖譜上的位置。*復制起點oriC*復制終點trpＣ、Ｂ、Ｆ允許反時針復制而阻止順時針復制,復制終點、Ａ、Ｄ、Ｅ則正相反參與DNA復制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。三、需要引物

1、DNA聚合酶不能催化兩個游離的dNTP聚合，而RNA聚合酶可以催化游離的NTP聚合。2、RNA引物可供dNTP延長之用。3、RNA引物以后被降解，減少復制初始的錯誤率。問題：為什么以RNA為引物？

DNA復制時，以復制起始點為中心，向兩個方向進行復制。在低等生物中，也可進行單向復制（如滾環復制）。

四、雙向復制

DNA復制的不同方式：*直線雙向*多起點雙向*θ型雙向*θ型單向*

滾環復制

（rollingcirclereplication）簡單低等生物或染色體以外的DNA采取的特殊復制形式*Ｄ環(D-loop)復制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3'→5'。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。

五、半不連續復制以3‘→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復制時基本上是連續進行的，其子代鏈的聚合方向為5‘→3’，這一條鏈被稱為領頭鏈(leadingstrand)。而以5‘→3’方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復制時則是不連續的，其鏈的聚合方向也是5‘→3’，這條鏈被稱為滯后鏈(laggingstrand)。由于親代DNA雙鏈在復制時是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復制時，由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。

岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。

第二節DNA復制的條件

一、底物(Substrate)

以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)為底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

DNA復制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進行復制。

二、模板(template)

引發體(primosome)由引發前體與引物酶（primase）組裝而成。引發前體是由若干蛋白因子聚合而成的復合體。在原核生物中，引發前體至少由六種蛋白因子構成。三、引發體和引物酶引物酶，催化引物合成的一種RNA聚合酶，本質上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。

1956年，Kornbereg在大腸桿菌提取液中發現DNA聚合酶，以后陸續在其他原核生物及微生物中找到。DNA聚合酶的反應特點：※以四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為底物;※反應需要模板的指導;※反應需要有引物3'-OH存在;※DNA鏈的生長方向是5'→3'※產物DNA的性質與模板相同。四、DNA聚合酶

(DDDP)DNA聚合酶催化的反應復制中的堿基配對（一）理化性質：純化的DNApolⅠ由一條單一多肽鏈組成，多肽鏈中含有一個鋅原子。酶分子空間結構近似球體。DNApolⅠ約含1000個氨基酸殘基，MW為109KD。經蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個片段：大片段（Klenow片段）有聚合酶和3'→5'外切酶活性，小片段有5'→3'外切酶活性。（A）、DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)（二）功能：

1．聚合功能:通過核苷酸聚合反應使DNA鏈沿5‘→3’方向延長（ＤＮＡ聚合酶）在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。2．3'→5'外切酶活性──校對作用:這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸（對單鏈作用）。3．5'→3'外切酶活性──切除修復作用:5‘→3’外切酶活性就是從5‘→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產生5‘-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5‘→3’。每次能切除10個核苷酸。這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用（切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體）。對岡崎片段5'末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。4．焦磷酸解作用:DNApolⅠ的這種活性可以催化3‘末端焦磷酸解DNA分子。5．焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應。

４和５兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。

（B）、DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNA復制的主要聚合酶。1970年發現了DNApolⅡ。此酶MW為88KD，每個細胞內約有100個酶分子，活性比DNApolⅠ高。大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ的催化特性如下：5’→3’聚合酶活力:該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長于100個核苷酸。有3’→5’外切酶活性，但無5’→3’外切酶活性。以四種脫氧核糖核苷酸為底物。該酶不是復制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復制都正常。（C）、DNA聚合酶Ⅲ（一）、組成

DNApolⅢ全酶是由多種亞基組成的蛋白質，而且容易分解。現在認為它是大腸桿菌細胞內真正負責從新合成DNA的復制酶。

α、ε和θ三種亞基組成全酶的核心酶，稱為polⅢ。α亞基具有5’→3’聚合DNA的酶活性，ε亞基具有校對功能，可提高聚合酶Ⅲ復制DNA的保真性。核心酶的活力較低，只作用于帶缺口的雙鏈DNA；加上τ亞基后就成為polⅢ’，它可以利用帶有引物的長單鏈DNA。再加上延長因子γ和δ成為polⅢ*，也即是“天然的”聚合酶Ⅲ。β亞基與對引物的識別和結合有關，一旦全酶結合到DNA復制的起始部位，它即被釋放出來，這一亞基又稱為共聚酶Ⅲ。組成（二）、功能1．聚合:以模板作指導，以四種脫氧核糖核苷酸作為底物，并且需要有3’－ＯＨ的引物鏈存在，通過核苷酸聚合反應使DNA鏈沿5’→3’方向延長。催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。與DNA聚合酶Ⅱ相同，最適模板也是雙鏈DNA中間有小段缺口（＜100個核苷酸）的單鏈DNA。2．3‘→5’外切酶活性和DNA聚合酶Ⅱ一樣，其3‘→5’外切酶活性的最適底物是帶有小段缺口（小于100個核苷酸）的雙鏈DNA。（ε亞基具有3‘→5’外切酶的活性，因而與DNA復制的校正功能有關）3．無5'→3'外切酶活性Nucleotide_Polymerization大腸桿菌DNA聚合酶原核生物中的三種DNA聚合酶

延長隨從鏈

備用，只在其他聚合酶無活性時才發揮作用線粒體DNA復制延長領頭鏈校讀、修復和填補缺口主要功能真核生物DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε名稱為了保證遺傳的穩定，DNA的復制必須具有高保真性。DNA復制時的保真性主要與下列因素有關：

1．遵守嚴格的堿基配對規律；

2．DNA聚合酶在復制時對堿基的正確選擇；

3．對復制過程中出現的錯誤及時進行校正。

DNA復制的保真性：DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，而使兩段DNA連接起來。五、DNA連接酶

DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3‘-OH，而另一段DNA片段具有5’-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈是完整的；③需要消耗能量ATP。

酶－AMP復合物AMP－DNAATP（動物中）（細菌中）磷酰胺鍵單鏈DNA結合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結合的蛋白質因子。其作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩定存在，即穩定單鏈DNA，便于以其為模板復制子代DNA；②保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

六、單鏈DNA結合蛋白

解螺旋酶（unwindingenzyme）

，又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。目前發現存在至少存在兩種解螺旋酶。

七、解螺旋酶

核酸的拓撲結構是指核酸分子的空間結構。兩條互相纏繞的雙螺旋核酸分子表現出許多拓撲學的關系。DNA的復制、重組、轉錄和組裝等過程牽涉到拓撲結構的轉變。八、拓撲異構酶(topoisomerase)

當將線性過旋或欠旋的雙螺旋DNA連接形成一個環時，都會自動形成額外的超螺旋(supercoil)來抵消過旋或欠旋造成的應力，目的是維持B構象。過旋DNA會自動形成額外左手螺旋，這樣的超螺旋稱為正超螺旋(positivesupereoil)；而欠旋形成額外右手螺旋，稱為負超螺旋(negativesupereoil）。正超螺旋：盤繞過分負超螺旋：盤繞不足通過切斷分子中的一條鏈或兩條鏈中的磷酸二酯鍵后，消除或增加扭轉張力，然后重新纏繞，再縫合切口，可以改變一個ＤＮＡ分子的連環數。催化這一過程的酶由于能夠改變DNA的拓撲異構特性，稱為拓撲異構酶。DNA拓撲酶催化同一DNA分子不同超螺旋狀態之間的轉變。拓撲異構酶Ⅰ通過切斷DNA的一條鏈，減少負超螺旋，增加連環數，每作用一次使連環數增加一個。反應無需供給能量。拓撲異構酶Ⅱ可切斷DNA雙鏈，引入負超螺旋，使連環數減少，每作用一次使連環數減少兩個。反應需要由ATP供給能量。兩種拓撲異構酶協同作用控制著DNA的負超螺旋水平，從而影響其功能。DNA雙鏈穿過DNA雙鏈重新連接DNA的釋放重復起始DNA雙鏈斷裂拓撲異構酶Ⅱ的作用機制第三節DNA生物合成過程DNA合成期（S期）有絲分裂期：（前、中、后、末期）間期：兩次分裂之間的一段時期（靜止期）DNA合成后期（G2）DNA合成前期（G1）Life_Cycle_of_a_Cell1．解旋解鏈，形成復制叉：

DNA復制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結構稱為復制叉。由拓撲異構酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結構解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結合蛋白（SSB）結合在兩條單鏈DNA上，形成復制叉。

一、復制的起始

DNA復制的起始階段，由下列兩步構成。

（一）預引發：

2．引發體組裝：

由蛋白因子（如dnaB等）識別復制起始點，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發體。

DnaA蛋白辨認E.coli上的復制起點并結合于重復序列的位點上DNA蛋白質復合體促使鄰近的DNA進行解鏈DnaB蛋白在DnaC蛋白的協同下結合于初步打開的雙鏈，并用解螺旋酶活性開鏈SSB參與作用（二）引發：

在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

二、復制的延長

（一）聚合子代DNA：

由DNA聚合酶催化，以3‘→5’方向的親代DNA鏈為模板，從5’→3’方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領頭鏈）。

引發體向前移動，解開新的局部雙螺旋，形成新的復制叉，隨從鏈重新合成RNA引物，繼續進行鏈的延長。

（二）引發體移動：三、復制的終止

在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。

（一）去除引物，填補缺口：DNA聚合酶Ⅰ水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA在DNA連接酶的催化下，形成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。（二）連接岡崎片段：Bidirectional_Replication拓撲異構酶rep蛋白DNA結合蛋白(SSB）引發體隨從鏈領頭鏈DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅢDNA連接酶RNA引物5’3’5’3’DNA復制體上的活動（1）雙鏈的解開（2）RNA引物的合成（3）DNA鏈的延長（4）切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段（5）切除和修復摻入DNA鏈的脫氧尿苷酸和錯配堿基線性DNA在復制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應。端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構部分，通常膨大成粒狀。其共同的結構特征是由一些富含G、C的短重復序列構成，可重復數十次至數百次。

（三）真核生物端粒的形成：

端粒酶是一種RNA-蛋白質復合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉錄過程對末端DNA鏈進行延長。

端粒酶的作用機制Telomere_Replication總結生物細胞DNA復制的分子機制的基本特點：1．復制是半保留的。2．復制起始于細菌或病毒的特定位置，真核生物有多個起始點。3．復制可以朝一個方向，也可以向兩個方向進行，后者更為常見。4．復制時，DNA的兩條鏈都從5’端向3’端延伸。5．復制是半不連續的。6．岡崎片段的合成始于一小段RNA引物，這一小段RNA以后被酶切除，缺口由脫氧核苷酸補滿后再與新生DNA鏈連在一起。7．復制有多種機制，即使在同一個細胞里，也可因環境——酶的豐富程度、溫度、營養條件等的不同而具有不同的起始機制和鏈延長的方式。Sanger提出的DNA核苷酸順序測定法：雙脫氧末端終止法突變的意義

第四節DNA的損傷(突變)與修復

1、突變是進化、分化的分子基礎由于DNA堿基順序的改變引起生物遺傳性狀顯著變化的現象，稱為基因“突變”。一切生物的變異和進化都可以認為是由于DNA結構的改變而引起蛋白質組成和性質變化的結果。2、只有基因型改變的突變

DNA多態性分析技術3、致死性的突變4、突變是某些疾病的發病基礎血友病、地中海貧血病等一、DNA的損傷（突變）

由自發的或環境的因素引起DNA一級結構的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯，鏈的斷裂，重組等。

（一）引起突變的因素：

1．自發因素：

(1)自發脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達近萬個核苷酸殘基。

(2)自發脫氨基：胞嘧啶自發脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達幾十到幾百個核苷酸殘基。

(3)復制錯配：由于復制時堿基配對錯誤引起的損傷，發生頻率較低。

2．物理因素：

能夠引起基因突變的物理因素主要包括：紫外線（UV）、高能射線和電離輻射等。當DNA受到大劑量紫外線（波長260nm附近）照射時，可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價聚合，形成二聚體，例如TT二聚體。X-射線以及放射性物質產生的輻射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化學性質的改變。另外，電離輻射將也能使DNA周圍環繞的其它分子（主要是水）產生具有很高活性的自由基，這些自由基能夠進一步與DNA分子反應，導致DNA結構發生變化。3.化學因素化學因素是引起DNA結構發生變化的最常見因素，主要包括：烷基化試劑，亞硝酸鹽以及堿基類似物等。烷基化試劑能夠與DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。除了堿基上有多個位置可被烷基化外，DNA鏈上磷酸二酯鍵中的氧也容易被烷基化，從而導致DNA鏈的斷裂。亞硝酸鹽能夠與堿基環外氨基作用，引起堿基的改變。例如A經亞硝酸鹽作用后變成次黃嘌呤（I），C經亞硝酸鹽作用后，則轉變成U。堿基類似物是一類結構與核酸堿基相似的人工合成或天然化合物，由于它們的結構與核酸的堿基相似，當這些物質進入細胞后能夠摻入到DNA鏈中，干擾DNA的正常復制和轉錄。常見的有堿基衍生物及稠環、稠雜環類化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它與胸腺嘧啶堿基的結構相似，能取代T與A配對。又如一種稱為二惡英的含氯芳香雜三環化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二惡英，簡稱TCDD），是一種具有強烈致癌和致畸物質。它能夠進入細胞并與DNA結合，導致DNA復制發生錯誤，從而可能誘發癌變。（二）DNA突變的類型：

堿基的轉換AC次黃嘌呤H1．同義突變：基因突變導致mRNA密碼子第三位堿基的改變但不引起密碼子意義的改變，其翻譯產物中的氨基酸殘基順序不變，但有時可引起翻譯效率降低。

2．誤義突變：基因突變導致mRNA密碼子堿基被置換，其意義發生改變，翻譯產物中的氨基酸殘基順序發生改變。

（三）DNA突變的效應：

3．無義突變：基因突變導致mRNA密碼子堿基被置換而改變成終止密碼子，引起多肽鏈合成的終止。

4．移碼突變：基因突變導致mRNA密碼子堿基被置換，引起突變點之后的氨基酸殘基順序全部發生改變。

二、DNA損傷的修復

DNA損傷的修復方式可分為直接修復和取代修復兩大類。

這是一種廣泛存在的修復作用。光復活能夠修復任何嘧啶二聚體的損傷。（一）直接修復：

1．光復活（lightrepairing）：

光修復過程：光復活酶（photo-lyase)識別嘧啶二聚體并與之結合形成復合物在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環打開，使之完全修復光復活酶從DNA上解離。

2．轉甲基作用：

在轉甲基酶的催化下，將DNA上的被修飾的甲基去除。此時，轉甲基酶自身被甲基化而失活。

3．直接連接：

DNA斷裂形成的缺口，可以在DNA連接酶的催化下，直接進行連接而封閉缺口。

這也是一種廣泛存在的修復機制，可適用于多種DNA損傷的修復。該修復機制可以分別由兩種不同的酶來發動，一種是核酸內切酶，另一種是DNA糖苷酶。

（二）取代修復：

1．切除修復(excisionrepairing)：

結構缺陷切開切除修復連接堿基缺陷或錯配堿基丟失切開切除堿基取代N－糖苷酶DNA損傷的切除修復過程2．重組修復(binationrepairing)：這是DNA的復制過程中所采用的一種有差錯的修復方式。許多能造成DNA損傷或抑制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反應（SOSresponse）。這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復制受到抑制時出現的修復機制，以SOS借喻細胞處于危急狀態。3．SOS修復：DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復制過程在損傷部位受到抑制。損傷誘導一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產生。由這些特異性較低的酶繼續催化損傷部位DNA的復制，復制完成后，保留許多錯誤的堿基，從而造成突變。（1）SOS反應誘導的