實(shí)驗(yàn)二：PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性中山醫(yī)學(xué)院生化教研室實(shí)驗(yàn)二：PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性中山醫(yī)學(xué)院生化教研室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、基因PCR（已完成）；2、鑒定apoB基因PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳：1.5%瓊脂糖凝膠濃度，100V，1h；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、基因PCR（已完成）；1原理

在pH8.0（堿性）的環(huán)境中DNA的磷酸基團(tuán)解離，使DNA在該環(huán)境中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因?yàn)楦鞣NDNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同，它們?cè)谕ㄟ^(guò)凝膠立體網(wǎng)格時(shí)所受的動(dòng)力和阻力不同，所以泳動(dòng)的速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。

DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。3一、DNA瓊脂糖凝膠電泳1原理3一、DNA瓊脂糖凝膠電泳1.1影響DNA在凝膠中遷移速率的因素1DNA分子的大小：分子量越大，遷移速度越慢；2構(gòu)象：共價(jià)閉環(huán)DNA分子>直線(xiàn)DNA>開(kāi)環(huán)雙鏈DNA；3凝膠濃度：濃度越大，孔徑越小，DNA分子遷移越慢；4電壓：電壓越高，DNA分子遷移越快；5緩沖液：堿性環(huán)境保證DNA分子帶負(fù)電荷。1.1影響DNA在凝膠中遷移速率的因素1DNA分子的大1.2不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V)DNA分子的有效分離范圍（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-21.2不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V2實(shí)驗(yàn)材料及試劑

瓊脂糖電泳緩沖液：1TAE（Trisacetate-EDTAbuffer）

6加樣緩沖液（溴酚藍(lán)/二甲苯青/甘油）

EB染色液（溴化乙錠，ethidiumbromide）2實(shí)驗(yàn)材料及試劑瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1.5%的預(yù)染或未染的凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）將膠置于電泳槽（注意上樣孔位于電泳槽負(fù)極一側(cè)）倒緩沖液（沒(méi)過(guò)膠約1mm）

實(shí)驗(yàn)步驟上樣瓊脂糖凝膠板的制備紫外燈下檢測(cè)（apoB基因PCR產(chǎn)物：雙條帶或單條帶，700bp左右）取apoB基因PCR產(chǎn)物20μl上樣（按學(xué)號(hào)加樣：DNAmarker，樣品1,樣品2,樣品3,樣品4）apoB基因PCR產(chǎn)物電泳（1.5%膠，100V,1小時(shí)）紫外燈下檢測(cè)取apoB基因PCR產(chǎn)物20μl上樣apoB基年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件1.電泳前準(zhǔn)備準(zhǔn)備內(nèi)容作用1.刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水洗凈晾干防止不必要的重復(fù)污染，減少外來(lái)的污染。梳子干凈有利于梳孔的形成。2.檢查電泳槽，根據(jù)情況更換buffer排除電泳槽的電極接觸不良，確保buffer的緩沖能力，減少污染。3.根據(jù)DNA的分離范圍選擇合適的膠濃度并記錄達(dá)到較好的分離效果，防止樣過(guò)快跑出膠或者是過(guò)慢浪費(fèi)時(shí)間。4.計(jì)算agarose的用量和制膠

buffer的用量記錄，膠最終越薄越好。實(shí)驗(yàn)記錄備查1.電泳前準(zhǔn)備1.刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水2.制膠步驟注意事項(xiàng)1.稱(chēng)量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，稱(chēng)量相對(duì)準(zhǔn)確2.融膠，加熱到膠產(chǎn)生大量的氣泡時(shí)，拿出搖勻，繼續(xù)加熱到完全溶解，拿出搖勻，再加熱到沸騰。非常熱，小心燙手，另外注意不要加熱過(guò)度使膠沖出瓶子。因此注意選擇起碼為膠體積2倍以上的瓶子。保證膠混勻和完全溶解，減少可能因此引起的膠中孔徑不均勻影響分離效果。3.倒膠，可用水浴的辦法使膠冷卻到60度左右，即手可以握住瓶子的溫度，沿著制膠板的一側(cè)，緩緩地一次性倒入。梳子最好是預(yù)先放好并固定的，注意梳孔的體積能點(diǎn)的下所有的樣。用槍頭趕掉氣泡。制膠的桌面相對(duì)水平。倒膠時(shí)盡量減少氣泡的產(chǎn)生。EB如果在制膠時(shí)加入，在60度左右時(shí)加入，使終濃度為0.5ug/ml。不宜過(guò)低，染色成像不明顯；不宜過(guò)高，導(dǎo)致背景太深。搖勻要沿著瓶壁搖動(dòng)，盡量減少氣泡產(chǎn)生的可能性。高濃度膠例如2%以上的EB很難搖勻，而且凝的速度也相對(duì)快，強(qiáng)烈建議跑完膠之后再用EB染色。4.室溫凝膠30分鐘過(guò)程中不要碰到梳子，盡量保持膠的位置不移動(dòng)。時(shí)間不宜過(guò)久，導(dǎo)致膠干燥變形；不宜過(guò)短，影響膠內(nèi)部孔徑形成。5.拔梳子，放入電泳槽。緩緩地將梳子垂直從梳孔拔出，盡可能使梳子是同時(shí)從各個(gè)膠孔拔出的。暫時(shí)不用的膠最好放入電泳槽電泳液中浸泡。電泳液要浸沒(méi)膠1mm。2.制膠注意事項(xiàng)1.稱(chēng)量agarose和bufferBuf3.上樣電泳步驟注意事項(xiàng)1.樣品中加入loadingbuffer使其終濃度為1X，混勻Loadingbuffer濃度不宜過(guò)低，點(diǎn)樣時(shí)樣品不能很好的沉在膠孔里；不宜過(guò)高，電泳時(shí)容易形成帶形的變形。注意混勻。2.點(diǎn)樣（每孔10ul）②apoB基因PCR產(chǎn)物電泳（1.5%膠，60v，2小時(shí)）沿著膠孔的邊緣勻速加入。盡量避免碰壞膠孔。槍頭不要吸過(guò)多的氣泡，拔起時(shí)不要過(guò)猛帶出樣品。每點(diǎn)一個(gè)樣完，吸取buffer洗槍頭，避免樣品混雜。如果是有特殊要求，例如回收，強(qiáng)烈建議每點(diǎn)一個(gè)樣換一次槍頭。加樣的速度當(dāng)然是越快越好，注意保證質(zhì)量。點(diǎn)樣的量不要太大，一方面是體積不要太大，溢出污染鄰位樣品；一方面不量要太大，容易導(dǎo)致脫尾和模糊不清。3.接通電源，選擇合適的電壓和時(shí)間電泳。膠孔與電極成水平狀態(tài)，防止樣品跑歪。跑膠期間不時(shí)回來(lái)看看，防止樣品跑出膠等意外發(fā)生。3.上樣電泳注意事項(xiàng)1.樣品中加入loadingbuff4.染色成像步驟注意事項(xiàng)1.染色如果膠中沒(méi)有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染5-10分鐘。2.調(diào)整鏡頭的拍攝范圍和焦距，成像3.打印照片做分析記錄4.染色成像注意事項(xiàng)1.染色如果膠中沒(méi)有加入EB，用0.5又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(“freebacteria”cloningtechnique)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過(guò)活細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107～108倍，大大提高了DNA的得率。因此，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

二、聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)

（PolymeraseChainReaction,PCR）又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(“freebacteria”clonKaryMullisPCR技術(shù)最早由美國(guó)Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室KaryMullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的；KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

KaryMullisPCR技術(shù)最早由美國(guó)Cetus（一）原理PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴(lài)的酶促合成反應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分三步。（一）原理PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對(duì)

結(jié)合延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的

條件下，引物3’端向前延伸，合

成與模板配對(duì)的新鏈PCR由上述高溫變性、低溫退火及適當(dāng)溫度延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行后使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈PCR由上述高溫變性、低溫5‘3‘3‘5‘5‘3‘3‘5‘（二）PCR反應(yīng)體系的組成及功能

PCR的完成是在一個(gè)0.5ml的EP管中完成，一個(gè)完整的PCR反應(yīng)體系應(yīng)包括以下成分：1.引物2.模板DNA3.TaqDNA聚合酶4.dNTP5.10×PCR反應(yīng)buffer（含鎂離子）（二）PCR反應(yīng)體系的組成及功能1、引物：人工合成短寡核苷酸是預(yù)擴(kuò)增DNA片段兩端的已知序列，是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，目的是提高擴(kuò)增的效率與特異性。終濃度為0.1~0.5umol/L，濃度過(guò)高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過(guò)低，不足以完成30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會(huì)降低PCR的產(chǎn)率。1、引物：

◆設(shè)計(jì)原則：（1）引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。（2）引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。（3）引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件（4）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。Primer本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列,形成內(nèi)部loop環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu),如：GGGTCGATTCCTACCCATGC注意減少Primer間互補(bǔ)序列,導(dǎo)致2個(gè)Primer形成dimer,一般不要超過(guò)3個(gè)互補(bǔ)bp如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC（5）

引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

（6）引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。

（4）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是

修飾：

如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果

突變：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：絕不可以在3'端進(jìn)行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補(bǔ)→不能延伸

（7）Primer5’未端可修飾、突變:（7）Primer5’未端可修飾、突變:

（8）primer5’端增加堿基:

引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。①內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)：（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG↑保護(hù)bp

對(duì)PCR產(chǎn)物cloning有很大好處②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無(wú)膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。

（8）primer5’端增加堿基:引物設(shè)計(jì)軟件

PrimerPremier5.0（自動(dòng)搜索）*

Oligo6（引物評(píng)價(jià)）

VectorNTISuit

DNAsis

Omiga

DNAstar

Primer3（在線(xiàn)服務(wù)）引物設(shè)計(jì)軟件

2.TaqDNA聚合酶水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶，其特點(diǎn)有：①5’3’DNA聚合酶活性；②無(wú)3’5’外切酶活性，因此無(wú)校正功能；③有良好的熱穩(wěn)定性，最適聚合酶溫度72℃，選擇72℃延伸；④半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min變性溫度≤95℃，使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性；⑤其活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感；⑥終濃度一般為：2.5U/100ul；

2.TaqDNA聚合酶

3.

模板DNA（1）模板用量——Plasmid:1ng,Chromosome:300-500ng,一般認(rèn)為102~104拷貝模板就可以滿(mǎn)足要求。（2）可選DNA——質(zhì)粒、噬菌體、染色體DNA

注意：防止交叉污染3.模板DNA4.dNTP

（1）四種脫氧核苷酸，基本原料,四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)誘導(dǎo)聚合酶的錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過(guò)早終止反應(yīng)

（2）已有商品化的混合液，終濃度一般為20-200umol/L,高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低，勢(shì)必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效4.dNTP5.

10×PCR反應(yīng)buffer

(1)250~500mmol/LKCl；(2)100~500mmol/LTris-HAC(pH8.4)；(3)15~20mmol/LMgCl2（對(duì)Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.5~2.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時(shí)根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整）；(4)0.1%明膠或牛血清白蛋白5.10×PCR反應(yīng)bufferMg2+

(1)TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+(2)不同的酶需不同Mg2+(3)Taq：Mg2+

對(duì)反應(yīng)影響很大，1-3mM終濃度外界影響：(1)EDTA鰲合Mg2+選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；(2)DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+

結(jié)合，降低Mg2+有效濃度如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整Mg2+濃度Mg2+年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件（三）

PCR反應(yīng)條件PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間（變性、退火、延伸）

PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺(tái)效應(yīng)

（三）PCR反應(yīng)條件

（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長(zhǎng)度很長(zhǎng)，則變性時(shí)間↑

（2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于引物Tm值：Tm值=4(G+C)＋2(A+T)；

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)，一般在45～55℃；Tm↑退火T↑，Tm↓退火T↓；

若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3)延伸：72℃1min/kb（10kb內(nèi)）

一般：40－60sec

溫度和時(shí)間（1）變性溫度：94-95℃溫度和時(shí)間平臺(tái)效應(yīng)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，引物、底物的消耗、DNA聚合酶活性下降及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩兀粩U(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線(xiàn)性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，大多數(shù)情況下，平臺(tái)期(Plateauphase)的到來(lái)是不可避免的。PlateauphaseinPCR

平臺(tái)效應(yīng)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上apoB基因PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟體系25l

Mix12.5l

引物2l

ddH2O6.5l

模板4l

步驟溫度時(shí)間預(yù)變性94℃5min變性94℃1min退火+延伸60℃4min延伸60℃10min35cycles循環(huán)數(shù)apoB基因PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟體系25lMix1（四）PCR的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單省時(shí)：1-2hr靈敏度高：pg特異性強(qiáng)對(duì)原始材料質(zhì)量要求低有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入適用于克隆序列清楚的基因（四）PCR的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單（五）PCR的應(yīng)用1．遺傳病的產(chǎn)前診斷：如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏；2．致病病原體的檢測(cè)：對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細(xì)菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲(chóng)（如梅毒螺旋體）等來(lái)說(shuō)尤為適用。；3．癌基因的檢測(cè)和診斷：白血病殘留細(xì)胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神經(jīng)質(zhì)瘤N-myc基因的激活和表達(dá)；4．DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證：肌紅蛋白小衛(wèi)星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重復(fù)次數(shù)的差異都被應(yīng)用于鑒定，骨髓或臟器移植配型及動(dòng)物種系的研究；5．動(dòng)、植物檢疫：檢查出入國(guó)門(mén)的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動(dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門(mén)氏菌等；6．高科技生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中檢查植入基因的存在。7.PCR技術(shù)尚可應(yīng)用于基因拼接、測(cè)序等領(lǐng)域。

（五）PCR的應(yīng)用1．遺傳病的產(chǎn)前診斷：如地中海貧血、鐮刀參考書(shū)目PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南黃培堂等譯，1998年6月第一版，科學(xué)出版社PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南（第二版）（影印），CarlW.Dieffenbach,GabrielaS.Dveksler，2003，ColdSpringHarborLab(CSHL)Press，科學(xué)出版社PCR傳奇——一個(gè)生物技術(shù)的故事，保羅拉比諾潘濤等著，朱玉賢譯，1998-12第一版，上海科技教育出版社參考書(shū)目PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南黃培堂等譯，1998年6月第一

三、基因多態(tài)性(geneticpolymorphism)基因多態(tài)性（polymorphism）是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型（genotype）或等位基因（allele）。從本質(zhì)上來(lái)講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒(méi)有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。對(duì)于一個(gè)體而言，基因多態(tài)性堿基順序終生不變，并按孟德?tīng)栆?guī)律世代相傳。三、基因多態(tài)性(geneticpolymorphism1基因多態(tài)性產(chǎn)生的原因單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變即核苷酸的替換單一DNA序列的插入或缺失整串DNA序列的插入或缺失基因轉(zhuǎn)換1基因多態(tài)性產(chǎn)生的原因單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變即核苷酸的替換2基因多態(tài)性類(lèi)型的檢測(cè)（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記：由于限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)或位點(diǎn)間DNA區(qū)段發(fā)生突變引起的。（2）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)標(biāo)記：RAPD是通過(guò)短的隨機(jī)引物擴(kuò)增個(gè)體基因組DNA體現(xiàn)多態(tài)性。（3）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(AFLP)多態(tài)性標(biāo)記：AFLP是將PCR技術(shù)與RFLP結(jié)合的一種方法，通過(guò)對(duì)基因組DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)DNA酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。（4）微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記(SSRP)：基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記，多態(tài)性是由同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同而產(chǎn)生的。（5）單鏈構(gòu)象多態(tài)性標(biāo)記(SSCP)（6）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)：將被測(cè)DNA片段與高密度DNA探針(中部單核苷酸替代探針)微陣列雜交，一次性快速顯示被測(cè)序列的單核苷酸多態(tài)性，并通過(guò)計(jì)算機(jī)分析雜交類(lèi)型，最終顯示SNP結(jié)果。2基因多態(tài)性類(lèi)型的檢測(cè)（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RF隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)

由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致；由人工隨機(jī)合成的DNA分子為引物，以基因組DNA為模板，進(jìn)行多態(tài)性DNA片段的隨機(jī)合成。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色分析，就可直接在紫外光線(xiàn)下看到新合成的DNA分子片段形成的不同條帶。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)由Willi不同品種雞基因組的RAPD分析圖不同品種雞基因組的RAPD分析圖3DNA多態(tài)性在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用（1）個(gè)體疾病的診斷（2）個(gè)體疾病的預(yù)防（3）個(gè)體化用藥的指導(dǎo)（4）個(gè)體身份的驗(yàn)證3DNA多態(tài)性在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用（1）個(gè)體疾病的診斷載脂蛋白B基因位于2號(hào)染色體斷臂末端，全長(zhǎng)43Kb；DNA3’端181bp構(gòu)成一種由11-16bp重復(fù)排列的超變異小衛(wèi)星序列，分布在500-800bp之間；ApoB載脂蛋白B基因位于2號(hào)染色體斷臂末端，全長(zhǎng)43Kb；ApoapoBDNA多態(tài)性或遺傳變異與高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗賽、冠心病以及肥胖之間密切相關(guān)；apoB一個(gè)位點(diǎn)或幾個(gè)位點(diǎn)的微小變異均可能引起高膽固醇和高甘油三酯血癥;apoB基因短缺或蛋白截短都可能引起低膽固醇血癥或低脂蛋白血癥。apoBDNA多態(tài)性或遺傳變異與高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化

PCR-VNTR(VariablenumbleoftandemlyrepeatedshortDNAsequence)多態(tài)性檢測(cè)PCR；電泳檢測(cè)PCR-VNTR(Variablenumbleoft本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目標(biāo)：通過(guò)觀察電泳條帶的差異，檢測(cè)來(lái)自不同樣本的apoB基因的多態(tài)性.本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目標(biāo)：通過(guò)觀察電泳條帶的差異，檢測(cè)來(lái)自不同樣本的apoB基因PCR產(chǎn)物鑒定600bp700bpapoB基因PCR產(chǎn)物鑒定600bp700bpThankyou!Thankyou!Thankyou!Thankyou!實(shí)驗(yàn)二：PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性中山醫(yī)學(xué)院生化教研室實(shí)驗(yàn)二：PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性中山醫(yī)學(xué)院生化教研室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、基因PCR（已完成）；2、鑒定apoB基因PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳：1.5%瓊脂糖凝膠濃度，100V，1h；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、基因PCR（已完成）；1原理

在pH8.0（堿性）的環(huán)境中DNA的磷酸基團(tuán)解離，使DNA在該環(huán)境中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)，因?yàn)楦鞣NDNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同，它們?cè)谕ㄟ^(guò)凝膠立體網(wǎng)格時(shí)所受的動(dòng)力和阻力不同，所以泳動(dòng)的速度有差異，以此達(dá)到分離的目的。

DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。54一、DNA瓊脂糖凝膠電泳1原理3一、DNA瓊脂糖凝膠電泳1.1影響DNA在凝膠中遷移速率的因素1DNA分子的大小：分子量越大，遷移速度越慢；2構(gòu)象：共價(jià)閉環(huán)DNA分子>直線(xiàn)DNA>開(kāi)環(huán)雙鏈DNA；3凝膠濃度：濃度越大，孔徑越小，DNA分子遷移越慢；4電壓：電壓越高，DNA分子遷移越快；5緩沖液：堿性環(huán)境保證DNA分子帶負(fù)電荷。1.1影響DNA在凝膠中遷移速率的因素1DNA分子的大1.2不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V)DNA分子的有效分離范圍（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-21.2不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V2實(shí)驗(yàn)材料及試劑

瓊脂糖電泳緩沖液：1TAE（Trisacetate-EDTAbuffer）

6加樣緩沖液（溴酚藍(lán)/二甲苯青/甘油）

EB染色液（溴化乙錠，ethidiumbromide）2實(shí)驗(yàn)材料及試劑瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1.5%的預(yù)染或未染的凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）將膠置于電泳槽（注意上樣孔位于電泳槽負(fù)極一側(cè)）倒緩沖液（沒(méi)過(guò)膠約1mm）

實(shí)驗(yàn)步驟上樣瓊脂糖凝膠板的制備紫外燈下檢測(cè)（apoB基因PCR產(chǎn)物：雙條帶或單條帶，700bp左右）取apoB基因PCR產(chǎn)物20μl上樣（按學(xué)號(hào)加樣：DNAmarker，樣品1,樣品2,樣品3,樣品4）apoB基因PCR產(chǎn)物電泳（1.5%膠，100V,1小時(shí)）紫外燈下檢測(cè)取apoB基因PCR產(chǎn)物20μl上樣apoB基年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件1.電泳前準(zhǔn)備準(zhǔn)備內(nèi)容作用1.刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水洗凈晾干防止不必要的重復(fù)污染，減少外來(lái)的污染。梳子干凈有利于梳孔的形成。2.檢查電泳槽，根據(jù)情況更換buffer排除電泳槽的電極接觸不良，確保buffer的緩沖能力，減少污染。3.根據(jù)DNA的分離范圍選擇合適的膠濃度并記錄達(dá)到較好的分離效果，防止樣過(guò)快跑出膠或者是過(guò)慢浪費(fèi)時(shí)間。4.計(jì)算agarose的用量和制膠

buffer的用量記錄，膠最終越薄越好。實(shí)驗(yàn)記錄備查1.電泳前準(zhǔn)備1.刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水2.制膠步驟注意事項(xiàng)1.稱(chēng)量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，稱(chēng)量相對(duì)準(zhǔn)確2.融膠，加熱到膠產(chǎn)生大量的氣泡時(shí)，拿出搖勻，繼續(xù)加熱到完全溶解，拿出搖勻，再加熱到沸騰。非常熱，小心燙手，另外注意不要加熱過(guò)度使膠沖出瓶子。因此注意選擇起碼為膠體積2倍以上的瓶子。保證膠混勻和完全溶解，減少可能因此引起的膠中孔徑不均勻影響分離效果。3.倒膠，可用水浴的辦法使膠冷卻到60度左右，即手可以握住瓶子的溫度，沿著制膠板的一側(cè)，緩緩地一次性倒入。梳子最好是預(yù)先放好并固定的，注意梳孔的體積能點(diǎn)的下所有的樣。用槍頭趕掉氣泡。制膠的桌面相對(duì)水平。倒膠時(shí)盡量減少氣泡的產(chǎn)生。EB如果在制膠時(shí)加入，在60度左右時(shí)加入，使終濃度為0.5ug/ml。不宜過(guò)低，染色成像不明顯；不宜過(guò)高，導(dǎo)致背景太深。搖勻要沿著瓶壁搖動(dòng)，盡量減少氣泡產(chǎn)生的可能性。高濃度膠例如2%以上的EB很難搖勻，而且凝的速度也相對(duì)快，強(qiáng)烈建議跑完膠之后再用EB染色。4.室溫凝膠30分鐘過(guò)程中不要碰到梳子，盡量保持膠的位置不移動(dòng)。時(shí)間不宜過(guò)久，導(dǎo)致膠干燥變形；不宜過(guò)短，影響膠內(nèi)部孔徑形成。5.拔梳子，放入電泳槽。緩緩地將梳子垂直從梳孔拔出，盡可能使梳子是同時(shí)從各個(gè)膠孔拔出的。暫時(shí)不用的膠最好放入電泳槽電泳液中浸泡。電泳液要浸沒(méi)膠1mm。2.制膠注意事項(xiàng)1.稱(chēng)量agarose和bufferBuf3.上樣電泳步驟注意事項(xiàng)1.樣品中加入loadingbuffer使其終濃度為1X，混勻Loadingbuffer濃度不宜過(guò)低，點(diǎn)樣時(shí)樣品不能很好的沉在膠孔里；不宜過(guò)高，電泳時(shí)容易形成帶形的變形。注意混勻。2.點(diǎn)樣（每孔10ul）②apoB基因PCR產(chǎn)物電泳（1.5%膠，60v，2小時(shí)）沿著膠孔的邊緣勻速加入。盡量避免碰壞膠孔。槍頭不要吸過(guò)多的氣泡，拔起時(shí)不要過(guò)猛帶出樣品。每點(diǎn)一個(gè)樣完，吸取buffer洗槍頭，避免樣品混雜。如果是有特殊要求，例如回收，強(qiáng)烈建議每點(diǎn)一個(gè)樣換一次槍頭。加樣的速度當(dāng)然是越快越好，注意保證質(zhì)量。點(diǎn)樣的量不要太大，一方面是體積不要太大，溢出污染鄰位樣品；一方面不量要太大，容易導(dǎo)致脫尾和模糊不清。3.接通電源，選擇合適的電壓和時(shí)間電泳。膠孔與電極成水平狀態(tài)，防止樣品跑歪。跑膠期間不時(shí)回來(lái)看看，防止樣品跑出膠等意外發(fā)生。3.上樣電泳注意事項(xiàng)1.樣品中加入loadingbuff4.染色成像步驟注意事項(xiàng)1.染色如果膠中沒(méi)有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染5-10分鐘。2.調(diào)整鏡頭的拍攝范圍和焦距，成像3.打印照片做分析記錄4.染色成像注意事項(xiàng)1.染色如果膠中沒(méi)有加入EB，用0.5又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(“freebacteria”cloningtechnique)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過(guò)活細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107～108倍，大大提高了DNA的得率。因此，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

二、聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)

（PolymeraseChainReaction,PCR）又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(“freebacteria”clonKaryMullisPCR技術(shù)最早由美國(guó)Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室KaryMullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的；KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

KaryMullisPCR技術(shù)最早由美國(guó)Cetus（一）原理PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴(lài)的酶促合成反應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分三步。（一）原理PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對(duì)

結(jié)合延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的

條件下，引物3’端向前延伸，合

成與模板配對(duì)的新鏈PCR由上述高溫變性、低溫退火及適當(dāng)溫度延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行后使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈PCR由上述高溫變性、低溫5‘3‘3‘5‘5‘3‘3‘5‘（二）PCR反應(yīng)體系的組成及功能

PCR的完成是在一個(gè)0.5ml的EP管中完成，一個(gè)完整的PCR反應(yīng)體系應(yīng)包括以下成分：1.引物2.模板DNA3.TaqDNA聚合酶4.dNTP5.10×PCR反應(yīng)buffer（含鎂離子）（二）PCR反應(yīng)體系的組成及功能1、引物：人工合成短寡核苷酸是預(yù)擴(kuò)增DNA片段兩端的已知序列，是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，目的是提高擴(kuò)增的效率與特異性。終濃度為0.1~0.5umol/L，濃度過(guò)高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過(guò)低，不足以完成30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會(huì)降低PCR的產(chǎn)率。1、引物：

◆設(shè)計(jì)原則：（1）引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。（2）引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。（3）引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件（4）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。Primer本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列,形成內(nèi)部loop環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu),如：GGGTCGATTCCTACCCATGC注意減少Primer間互補(bǔ)序列,導(dǎo)致2個(gè)Primer形成dimer,一般不要超過(guò)3個(gè)互補(bǔ)bp如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC（5）

引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

（6）引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。

（4）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是

修飾：

如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果

突變：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：絕不可以在3'端進(jìn)行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補(bǔ)→不能延伸

（7）Primer5’未端可修飾、突變:（7）Primer5’未端可修飾、突變:

（8）primer5’端增加堿基:

引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。①內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)：（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG↑保護(hù)bp

對(duì)PCR產(chǎn)物cloning有很大好處②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無(wú)膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。

（8）primer5’端增加堿基:引物設(shè)計(jì)軟件

PrimerPremier5.0（自動(dòng)搜索）*

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Primer3（在線(xiàn)服務(wù)）引物設(shè)計(jì)軟件

2.TaqDNA聚合酶水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶，其特點(diǎn)有：①5’3’DNA聚合酶活性；②無(wú)3’5’外切酶活性，因此無(wú)校正功能；③有良好的熱穩(wěn)定性，最適聚合酶溫度72℃，選擇72℃延伸；④半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min變性溫度≤95℃，使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性；⑤其活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感；⑥終濃度一般為：2.5U/100ul；

2.TaqDNA聚合酶

3.

模板DNA（1）模板用量——Plasmid:1ng,Chromosome:300-500ng,一般認(rèn)為102~104拷貝模板就可以滿(mǎn)足要求。（2）可選DNA——質(zhì)粒、噬菌體、染色體DNA

注意：防止交叉污染3.模板DNA4.dNTP

（1）四種脫氧核苷酸，基本原料,四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)誘導(dǎo)聚合酶的錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過(guò)早終止反應(yīng)

（2）已有商品化的混合液，終濃度一般為20-200umol/L,高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低，勢(shì)必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效4.dNTP5.

10×PCR反應(yīng)buffer

(1)250~500mmol/LKCl；(2)100~500mmol/LTris-HAC(pH8.4)；(3)15~20mmol/LMgCl2（對(duì)Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.5~2.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時(shí)根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整）；(4)0.1%明膠或牛血清白蛋白5.10×PCR反應(yīng)bufferMg2+

(1)TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+(2)不同的酶需不同Mg2+(3)Taq：Mg2+

對(duì)反應(yīng)影響很大，1-3mM終濃度外界影響：(1)EDTA鰲合Mg2+選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；(2)DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+

結(jié)合，降低Mg2+有效濃度如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整Mg2+濃度Mg2+年研究生實(shí)驗(yàn)2PCR檢測(cè)apoB基因多態(tài)性課件（三）

PCR反應(yīng)條件PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間（變性、退火、延伸）

PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺(tái)效應(yīng)

（三）PCR反應(yīng)條件

（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長(zhǎng)度很長(zhǎng)，則變性時(shí)間↑

（2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于引物Tm值：Tm值=4(G+C)＋2(A+T)；

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)，一般在45～55℃；Tm↑退火T↑，Tm↓退火T↓；

若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3)延伸：72℃1min/kb（10kb內(nèi)）

一般：40－60sec

溫度和時(shí)間（1）變性溫度：94-95℃溫度和時(shí)間平臺(tái)效應(yīng)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，引物、底物的消耗、DNA聚合酶活性下降及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩兀粩U(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線(xiàn)性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，大多數(shù)情況下，平臺(tái)期(Plateauphase)的到來(lái)是不可避免的。PlateauphaseinPCR

平臺(tái)效應(yīng)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上apoB基因PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟體系25l

Mix12.5l

引物2l

ddH2O6.5l

模板4l

步驟溫度時(shí)間預(yù)變性94℃5min變性94℃1min退火+延伸60℃4min延伸60℃10min35cycles循環(huán)數(shù)apoB基因PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟體系25lMix1（四）PCR的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單省時(shí)：1-2hr靈敏度高：pg特異性強(qiáng)對(duì)原始材料質(zhì)量要求低有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入適用于克隆序列清楚的基因（四）PCR的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單（五）PCR的應(yīng)用1．遺傳病的產(chǎn)前診斷：如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏；2．致病病原體的檢測(cè)：對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細(xì)菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲(chóng)（如梅毒螺旋體）等來(lái)說(shuō)尤為適用。；3．癌基因的檢測(cè)和診斷：白血病殘留細(xì)胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神經(jīng)質(zhì)瘤N-myc基因的激活和表達(dá)；4．DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證：肌紅蛋白小衛(wèi)星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重復(fù)次數(shù)的差異都被應(yīng)用于鑒定，骨髓或臟器移植配型及動(dòng)物種系的研究；5．動(dòng)、植物檢疫：檢查出入國(guó)門(mén)的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動(dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門(mén)氏菌等；6．高科技生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中檢查植入基因的存在。7.PCR