關于雞胚成纖維細胞制備第1頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六學習和掌握雞胚成纖維細胞的制備和培養方法；了解原代細胞培養的原理和方法。實驗目的第2頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六CEF的培養是在一定條件下，在體外模擬體內生理環境，使從體內取出的成纖維組織細胞生存、生長和傳代，并維持原有組織細胞的結構和功能特性。雞胚成纖維細胞元代培養第3頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六病毒能在易感的組織或單層細胞內增殖，并可產生細胞病變，因此，細胞培養是病毒學研究的重要手段，是進行病毒性疫苗生產和病毒性疾病診斷必不可少的工具。原代細胞培養是體外制備細胞培養物的必經過程，從供體體內取出組織分散成單個細胞接種于培養液中為初次培養，從初次培養到第一次傳代培養為原代培養。本實驗以雞胚成纖維細胞作為原代細胞，通過細胞培養實踐操作，認識和體會原代細胞的制備方法和影響細胞培養的主要因素，并掌握原代細胞培養的方法。實驗原理第4頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六超凈工作臺，檢卵燈，滅菌的細胞培養瓶、眼科剪、眼科鑷、平皿、吸管、離心管等；9-11日齡雞胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM營養液，75%酒精棉。實驗所需器材、試劑第5頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六（一）操作前的準備1、預熱培養液：把已經配制好的生長液、Hanks液和胰蛋白酶液放入37℃水浴鍋內預熱；2、用75%酒精棉擦拭雙手和紫外線照射過的超凈工作臺；3、正確擺放要使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染；4、點燃酒精燈.5、準備好將要使用的消毒后的培養瓶。6、取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。實驗步驟第6頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六（二）雞胚成纖維細胞的制備1、雞胚的處理（1）蛋殼消毒取9-11日齡的雞胚，用檢卵燈選取血管清楚、活動正常的雞胚，置蛋架上，令氣室端向上，用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位。（2）胚體采集以鑷子擊破卵殼氣室部位，并除去該部位卵殼。用無菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛尿囊膜和羊膜，用彎鑷子夾住雞胚頸部，移入滅菌的平皿內。用剪刀剪去胚頭、四肢及內臟，用PBS洗去體表血液，移入滅菌小燒杯中。實驗步驟第7頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六（3）胚體勻漿用滅菌剪將胚體剪碎至1mm3小碎塊。加入PBS（淹住組織碎塊即可），輕搖，靜置1-2min，待組織塊下沉，吸去上層懸液。重復2-3次（以除去其中的紅細胞），至上懸液不混濁為止，移入滅菌的錐形瓶中，吸去PBS。實驗步驟第8頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六2、分散細胞（1）胰酶消化將剪碎的組織塊放入錐形瓶中，加入適量的胰酶。包緊瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min輕輕搖動1次。當組織塊變得蓬松透明時，吸棄消化液，用PBS洗兩遍，中止消化。如再繼續消化，可破壞細胞膜而不易貼壁生長，如果消化不夠，則細胞不易分散。實驗步驟第9頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六（2）分散細胞將消化好的細胞懸液從水浴鍋中取出，棄去上層液體，加5mL含血清的DMEM生長液（DMEM營養液+5%犢牛血清+100IU/ml青鏈霉素，用7.5%NaHCO3溶液調pH7.2），以吸管反復吹吸數次，使細胞分散，此時可見生長液混濁，即為細胞懸液。靜置1min后，使未沖散的組織塊下沉。（3）過濾用4層脫脂紗布將吹打后的細胞過濾到平皿中，收集濾液。實驗步驟第10頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六（三）分裝與培養1、細胞計數用細胞計數器計數，根據計數結果，加入DMEM生長液，調整細胞濃度至50萬-60萬個/ml。實驗步驟第11頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六2、分裝與培養在培養瓶中加入2mLDMEM生長液(如果是50mL的培養瓶，加4mL生長液)，小心吸出過濾后的細胞懸液0.25mL至培養瓶中（如果是50mL的培養瓶，加0.5mL的細胞懸液)，吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日期，置37℃溫箱中培養(4h后細胞即可貼壁，24-36h生長成單層細胞，此時可更換培養液，并接種病毒)。分裝后2-4h不可大幅度移動培養瓶，以免影響細胞的貼壁和生長。實驗步驟第12頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六（四）細胞形態觀察檢查時注意培養液的顏色變化，變黃但不混濁表示有細胞生長，變紅表示細胞未生長或生長不佳。37℃培養24-48h后，于倒置顯微鏡下觀察，細胞可以長成單層，細胞透亮，呈纖維狀，細胞膜清晰。實驗步驟第13頁，共15頁，2022年，5月20日，18點50分，星期六五、注意事項1、整個過程嚴格無菌操作2、培養液不要太多，應有足夠的空間保證細胞對氧的需要3、放入CO2培養箱培養時，將CO2濃度控制在5%。4、吸除消化液，向瓶內注入PBS數毫升，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉。注意沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰酶液后，可不用PBS沖洗，直接加入培養液。5、細胞培養對玻璃器皿洗滌要求嚴格，徹底洗滌后用蒸餾水沖洗，再用雙蒸水沖