關于蛋白質分析和膜泡轉運第1頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六第一節細胞內蛋白質的分選

細胞內合成的蛋白質之所以能夠定向的轉運到特定的細胞器取決于蛋白質中包含的特殊信號序列和細胞器上特定的信號識別裝置。第2頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六一、信號假說與蛋白質分選信號蛋白質的分選（proteinsorting）信號序列的發現和證實1972年Milstein等發現骨髓瘤細胞中提取的免疫球蛋白分子的N端要比分泌到細胞外的免疫球蛋白分子N端的氨基酸序列多出一截。1975年Blobel和Sabatini等提出了”信號假說“布洛貝爾因為發現“蛋白質具有控制其在細胞內轉移和定位的信號”而獲得1999年度諾貝爾生理學/醫學獎。

G.Blobel第3頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六1.信號假說信號肽（signalpeptide）信號識別顆粒（signalrecognitionparticle，SRP）信號識別顆粒的受體（又稱停泊蛋白，dockingprotein，DP）第4頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（1）信號肽（signalpeptide）位于蛋白質的N端，一般由16～26個殘基組成包括疏水核心區、信號肽的C端和N端等3部分原核細胞某些分泌性蛋白的N端也具有信號序列信號肽的一級結構序列第5頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六信號肽似乎沒有嚴格的專一性第6頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（2）信號識別顆粒（SRP）由6種不同的蛋白質和一個由300個核苷酸組成的7SRNA結合組成的一種核糖核蛋白復合體第7頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六蛋白質翻譯過程與SRP、DP和微粒體的關系體外非細胞系統（cellfreesystem）進行蛋白質合成實驗，證實分泌性蛋白向rER（微粒體）腔內的轉運是同蛋白質翻譯過程偶聯進行的，這種分泌蛋白在信號肽引導下邊翻譯邊跨膜轉運的過程稱為共翻譯轉運（cotranslationaltranslocation）第8頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉運分泌性蛋白的合成與其跨越內質網膜的共翻譯轉運圖解圖示信號肽、SRP、DP及移位子之間的相互作用第9頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉運第10頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉運第11頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（4）膜整合蛋白的信號序列開始轉移序列（starttransfersequence）內在停止轉移錨定序列（internalstop-transferanchor

sequence,STA）內在信號錨定序列（internalsignalanchorsequence,SA）第12頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六內質網膜整合蛋白的拓撲學類型第13頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六2.蛋白質分選信號序列第14頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六信號肽與信號斑第15頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六二、蛋白質分選轉運的基本途徑與類型途徑（1）后翻譯轉運途徑（2）共翻譯轉運途徑類型（1）蛋白質的跨膜轉運（2）膜泡運輸（3）選擇性的門控轉運（4）細胞質基質中蛋白質的轉運第16頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六1.翻譯后轉運途徑：在細胞質基質游離核糖體上完成多肽鏈合成，然后轉運至膜圍繞的細胞器，如線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、細胞核及細胞質基質的特定部位。2.共翻譯轉運途徑：蛋白質合成起始后轉移至粗面內質網，新生肽邊合成邊轉入粗面內質網腔中，隨后經高爾基體轉運至溶酶體、細胞膜或分泌到細胞外，內質網與高爾基體本身的蛋白也是通過這條途徑分選的。蛋白質分選的基本途徑第17頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六跨膜轉運：主要指再細胞質基質中合成的蛋白質轉運到內質網、線粒體、質體（包括葉綠體）和過氧化物酶體等細胞器。膜泡運輸：蛋白質通過不同類型的轉運小泡從糙面內質網合成部位轉運至高爾基體，進而分選轉運至細胞的不同部位，其中涉及各種不同的運輸小泡的定向轉運，以及膜泡出芽與融合的過程。選擇性的門控轉運：在細胞質基質中合成的蛋白質通過核孔復合體選擇性地完成核輸入或從細胞核返回細胞質（核輸出）。細胞質基質中蛋白質的轉運：可能與細胞骨架系統相關。蛋白質分選轉運的4種基本類型第18頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六真核細胞蛋白質分選的主要途徑與類型第19頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三、蛋白質向線粒體、葉綠體和過氧化物酶體的分選信號肽導肽轉運肽PTS1/PTS2核定位信號NLS第20頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（一）蛋白質從細胞質基質輸入到線粒體蛋白質從細胞質基質輸入到線粒體基質蛋白質從細胞質基質輸入到線粒體內膜蛋白質從細胞質基質輸入到線粒體膜間隙第21頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六蛋白質從細胞質基質輸入到線粒體基質線粒體蛋白通過3種途徑從細胞質基質輸入到線粒體內膜線粒體蛋白通過兩種途徑從細胞質基質輸入到線粒體膜間隙核基因編碼的線粒體蛋白的轉運第22頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（二）葉綠體基質蛋白與類囊體蛋白的靶向輸入外膜蛋白內膜蛋白葉綠體基質蛋白類囊體膜蛋白類囊體腔蛋白第23頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六葉綠體蛋白從細胞質基質輸入到類囊體腔第24頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（三）過氧化物酶體蛋白的分選C端SKL(Ser-Lys-Leu)靶向序列可溶性細胞質受體過氧化物酶體膜受體信號序列不被切除ATP水解(?)第25頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六第二節膜泡轉運第26頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六細胞猶如繁忙而巨大的港口，將正確的貨物在正確的時間運送到正確的地點是最為要緊的，囊泡就是港口的“穿梭巴士”。人們早已了解大量分子(即“乘客”)是“搭乘”囊泡在細胞內外往來，卻一直不了解這輛巴士是如何確定自己的啟程時間及目的地的。第27頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六JamesE.RothmanRandyW.SchekmanThomasC.SüdhofPrizemotivation:"fortheirdiscoveriesofmachineryregulatingvesicletraffic,amajortransportsysteminourcells"2013NobelPrizeinPhysiologyandMedicine第28頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六蘭迪·謝克曼

早在上世紀70年代，蘭迪·謝克曼便利用酵母作為模型，開始研究其遺傳學基礎。在基因篩選過程中，謝克曼分離出一類異常轉運機制的酵母細胞。這株酵母的“運輸狀況”與混亂的公共交通系統類似，囊泡都堆積在細胞的某一個角落。隨后，謝克曼發現了導致這一擁堵狀況的罪魁禍首——3類編碼調節囊泡運輸關鍵蛋白的基因。第29頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六上世紀80年代~90年代，詹姆斯·羅斯曼在哺乳動物細胞研究中發現了囊泡與“乘客”精確對接的奧秘——囊泡的膜及目的細胞器的膜上均有高度特異性的蛋白復合物，兩者能夠像拉鏈一樣緊密嵌合，從而使囊泡融合到細胞膜之中，由此解決了囊泡“釋放”問題，確保了“乘客”準確、及時到達。更為重要的是，回顧蘭迪·謝克曼發現的控制囊泡運輸的關鍵基因中，含有編碼詹姆斯·羅斯曼教授所發現的蛋白質復合物的基因，說明囊泡運輸在進化上的保守性。從低等生物(酵母)到高等生物(哺乳動物)均存在囊泡運輸，說明它是生命活動的基本途徑。第30頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六如果說羅斯曼與謝克曼的發現可以解釋囊泡作為一輛“穿梭巴士”是如何準確接送“乘客”的，那么祖德霍夫的研究成果則闡明細胞運輸系統在時間上的精確性，并指出“乘客”須有指令方能下車的信號問題。上世紀90年代，祖德霍夫聚焦于神經細胞中的鈣離子敏感蛋白，描摹出鈣離子流動的分子機制，并發現了突觸囊泡感受外界信號的關鍵因子和關鍵蛋白——鈣離子和鈣結合蛋白，通過它們，突觸小泡接受信號，快速準確地釋放，完成神經信號的傳遞。第31頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六一、膜泡運輸概觀1.蛋白質在rER合成，通過共翻譯轉運途徑跨膜運輸2.內質網出芽，形成轉運膜泡并與高爾基體融合3.從高爾基體順面膜囊和高爾基體順面網狀結構到rER的逆向運輸4.高爾基體膜囊從順面→反面成熟遞進（非膜泡過程）5.從高爾基體后期膜囊→早期膜囊的逆向運輸6.組成型分泌7.調節型分泌8.分選到溶酶體9.胞吞途徑蛋白質的分泌與胞吞途徑概觀第32頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三種包被的膜泡COPⅡ（coatproteinⅡ）包被膜泡COPⅠ（coatproteinⅠ）包被膜泡網格蛋白/接頭蛋白（clathrin/adaptorprotein）包被膜泡第33頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三種包被膜泡特征比較第34頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六二、COPⅡ包被膜泡的裝配與運輸COPⅡ包被蛋白組分小分子GTP結合蛋白Sar1Sec23/Sec24復合物Sec13/Sec31復合物大的纖維蛋白Sec16第35頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六細胞質中可溶性Sar1-GDP與ER膜蛋白Sec12（鳥苷酸交換因子）相互作用，催化GTP置換GDP形成Sar1-GTP，GTP的結合引發Sar1構象改變暴露出疏水N端并插入ER膜，膜結合Sar1對包被蛋白進一步裝配起募集者作用小分子GTP結合蛋白Sar1第36頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六1.Sar1與膜結合GTP交換2.COPⅡ包被裝配3.GTP水解4.COPⅡ包被去裝配Sar1蛋白在CopⅡ包被膜泡裝配與去裝配中作用第37頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六在內質網與高爾基體之間，分別由COPⅡ和COPⅠ膜泡介導蛋白質順向和逆向轉運不同類型的膜泡運輸第38頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六KDEL受體在從高爾基體回收內質網腔駐留蛋白中的作用不同類型的膜泡運輸第39頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六在供體膜內質網出芽及其轉運蛋白的包裝示意圖不同類型的膜泡運輸第40頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三、COPⅠ包被膜泡的裝配與運輸COPⅠ包被含有7種不同的蛋白質亞基和一種調節膜泡轉運的GTP結合蛋白ARF。ARF也是一種結合GDP/GTP轉換的分子開關調控蛋白。包被蛋白復合物的裝配與去裝配依賴于ARF所結合的核苷酸交換與水解過程第41頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六KDEL的受體主要定位在高爾基體TGN區、COPⅡ和COPⅠ包被膜泡的膜上，它們能識別并結合KDEL分選信號。如果在內質網發生錯誤包裝和轉運，由于COPⅠ膜泡上也有KDEL受體，所以也能保證逃逸蛋白被內質網回收KDEL的受體第42頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六四、網格蛋白/接頭蛋白包被膜泡的裝配與運輸網格蛋白/接頭蛋白包被膜泡介導的蛋白質分選途徑從高爾基體TGN向胞內體或向溶酶體、黑（色）素體、血小板囊泡和液泡的運輸受體介導的胞吞途徑中負責將物質從細胞表面運往胞內體轉而到溶酶體的運輸第43頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六網格蛋白及其包被膜泡的形成第44頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六五、轉運膜泡與靶膜的錨定與融合①供體膜的出芽、裝配和斷裂，形成不同的包被轉運膜泡②在細胞內由馬達蛋白驅動