1、基因工程原理第七章第1頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二動物細胞基因操作動物細胞基因操作的必須性:可進行細菌和真菌細胞所無法進行的真正的翻譯后修飾載體 1) 非復制質粒載體 2) 帶有病毒復制子的質粒 3) 病毒轉導載體細胞：與細胞本身特性、載體、轉移、應用相關轉移：轉移技術、瞬時與穩定轉染、共轉染應用：細胞研究、蛋白表達、體內基因治療、轉基因動物第2頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二第一節 動物細胞DNA轉移技術第3頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二動物細胞基因轉移的途徑=轉基因技術直接DNA轉移：外源DNA通過物理轉化

2、直接進入細胞 如顯微注射、含DNA顆粒轟擊、轉染：化學轉染技術、脂質體、電穿孔轉導：通過動物病毒包裹，利用病毒可以自然感染細胞并將自身核酸分子轉入細胞的能力。第4頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二轉染技術化學轉染技術(利用胞吞作用)1) DNA/磷酸鈣共沉淀法 適用于單層生長細胞，不適用于懸浮或成團生長的細胞 對某些細胞有毒性，難以轉染2) 二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran) 可溶性聚陽離子制劑，不能用于形成穩定的細胞系脂質體(利用胞吞作用) 低毒性，易操作，效率高，適用細胞類型多，甚至可轉染活體細胞電穿孔(利用電脈沖在細胞膜上形成瞬時的納米大小的孔）第5頁，

3、共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二轉移后DNA的命運具備在宿主細胞內發揮功能的復制起始子，可以穩定復制(穩定轉染)可以整合到基因組DNA上，穩定復制(穩定轉染)不具備在宿主細胞內發揮功能，也沒有整合到基因組DNA上，瞬時保留(瞬時轉染）DNA轉入細胞的效率遠高于DNA整合的效率兩個物理上不相連的基因可以發生共轉染，甚至可以都整合到基因組DNA上第6頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二第二節 動物細胞載體第7頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二動物細胞載體非復制型載體 瞬時轉染的載體(啟動子功能分析的載體) 選擇標記DNA帶有病毒復

4、制子的質粒 SV40、BPV、EBV病毒轉導載體 腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、Lentivirus等第8頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二瞬時轉染的非復制型載體載體無法復制，也不整合于基因組上在宿主細胞中往往只能保持1-2d的穩定可以進行基因的表達載體上往往具有報告基因，能夠報告表達的發生第9頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二啟動子功能分析與報告基因第10頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二選擇標記基因未經克隆的含TK基因的外源DNA使一些攝入細胞具有了在選擇培養基上生存的能力，這樣的基因稱為選擇性標記基因轉染實驗TK 胸苷

5、激酶第11頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二核苷酸從頭合成和補救途徑：編碼補救途徑的酶的基因(Hprt,Tk)可以用作選擇標記第12頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二共轉化與選擇標記兩個物理上不相連的基因通過共轉染，共同整合到基因組中的現象這是由于發生了整合之前的DNA融合只要能同時轉入一個選擇標記基因，共轉化現象就可以使任何外源DNA序列穩定轉入哺乳動物細胞根據標記基因篩選方法，選擇標記可以分為：內源性選擇標記、顯性選擇標記、擴增選擇標記第13頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二內源性選擇標記來自于動物細胞內的標記基因，大

6、多數涉及與冗余內源核苷酸生物合成途徑內源性選擇標記的缺點：只能用于那些對應基因不具有功能的突變細胞。第14頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二顯性選擇標記顯性選擇標記：往往來自于細菌(外源)，因此其所提供的表型對于細胞來說是全新的，可用于任何細胞。這些標記通常是細菌的抗藥基因，因此陽性細胞可以在適當的藥物濃度的培養基上進行篩選。第15頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二擴增選擇標記當動物細胞暴露在某種藥物的有毒濃度中，少數個別細胞由于自發的、擴增性的抗藥突變而存活，這樣的DNA上的擴增性標記，稱為擴增選擇標記出現擴增選擇性標記的細胞栽種群中是隨機出現

7、的，可進行高濃度抗藥性的篩選側翼DNA序列可隨標記基因一起擴增氨基蝶呤DHFR葉酸第16頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二擴增選擇標記擴增選擇標記也常可用于內源或顯性選擇標記，但常常用于擴增選擇的藥物不同第17頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二擴增選擇標記常用于外源基因的高效表達第18頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二復制子載體：帶有病毒復制子的載體病毒基因組具有在宿主細胞內獨立復制的能力可能造成溶解性感染，使宿主細胞裂解，如SV40，由于宿主細胞的裂解，實現的是一種高水平瞬時表達可能造成潛伏性感染，從而并不影響宿主細胞生

8、長，實現穩定轉染，如EBV和PBV，其中EBV載體相對于PBV載體復制更加穩定第19頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二SV40（猴多瘤病毒DNA）第20頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二病毒轉導載體外源DNA分子包入病毒粒子(通過連接或同源重組的方式插入病毒載體），后者吸附到細胞表面從而進入細胞效率很高，而且具有高效復制與高水平表達基因的潛能不僅可用于培養細胞，也可用于活體細胞腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、Lentivirus等第21頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二可復制病毒載體與復制缺陷型病毒載體當轉移基因插入到基因組中

9、或它所替換的基因對于在宿主細胞中的感染周期不是必需時，載體可以獨立的增殖，稱為可復制的或不依賴輔助病毒載體。當轉入基因替換了病毒的必需基因時，這樣的載體則稱為復制缺陷型或輔助病毒依賴性載體。因為它們失去的功能需要通過共轉入攜帶有載體所缺失基因的輔助病毒來提供。第22頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二可復制病毒載體與復制缺陷型病毒載體:以桿狀病毒為例第23頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二無內含載體不具有所有病毒編碼序列的載體，只含有包裝和基因組擴增所必需的順式作用元件。優點: 1) 可容納高容量的外源DNA 2) 不產生病毒基因產物，對細胞無毒性

10、第24頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二第三節 細胞與應用第25頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二正常動物細胞生長特性第26頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二宿主動物細胞所需特性第27頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二正常細胞生長特性和宿主細胞所需特性上的差異某種程度上造成了各種表達系統對宿主細胞選擇和應用的差異第28頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二第四節 動物基因操作第29頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二動物基因工程動物基因工程動物基因工程動物細

11、胞基因工程轉基因動物個體動物工程細胞動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質大規模生產藥物篩選研究評價模型第30頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二動物基因工程哺乳動物 轉基因小鼠 胚胎干細胞 同源重組 基因尋靶 克隆羊 核移植其他脊椎動物 爪蟾無脊椎動物 果蠅第31頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二產生轉基因哺乳動物的方法體細胞-卵細胞核替換顯微注射受精卵反病毒侵染胚胎干細胞或早期胚第32頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二轉基因小鼠大多數動物細胞在發育能力上受到限制，不能產生轉基因動物：分化的細胞無法完

12、全去分化和重復發育動物中實現生殖細胞系轉化的唯一途徑就是在形成生殖細胞系的發育階段之前把DNA導入全能細胞胚胎干細胞(Es Cells)是這樣一個動物體特殊的全能細胞第33頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二轉基因小鼠中的DNA轉移方法直接顯微注射：注入剛受精卵細胞的雄或雌性原核中重組反轉錄病毒：不適宜產生完全的轉基因動物，可用于形成胚轉基因部分Es細胞轉染：可利用標準標記進行篩選 第34頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二胚胎干細胞(Es Cells)取自生殖細胞發育前的早期胚具有發育成動物的所有組織的能力受同源重組影響顯著，可以用于基因尋靶，即可

13、用外源DNA的同源片段精確地替換內源基因組的片段。第35頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二Es細胞的基因尋靶外源DNA的同源片段精確替換內源基因組片段的過程由于同源重組的幾率遠低于隨機整合，進行尋靶的細胞需要有較高的同源重組能力體外操作的多能性、可操作性以及同源重組的能力使Es細胞成為唯一適合于產生定向突變小鼠的細胞，即在每個細胞中攜帶有相同突變并能將其傳遞給生殖細胞系的小鼠。標記基因已被運用到尋靶過程和其后的篩選 第36頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二尋靶載體特化的質粒載體，導入到Es細胞后可以促進同源重組促進同源重組的原因主要是含有一段同源區轉染前載體的線性化，有助于重組效率的提高多數基因尋靶是為了打斷內源基因位點，使之無效，稱為基因敲除第37頁，共39頁，2022年，5月20日，22點20分，星期二兩種類型的尋靶載體：替代與插入 插入載體是打