1、免疫化學(xué)法第1頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 第五章 免疫化學(xué)法1.前言 2.免化法的方法原理及特點(diǎn)3.抗體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià) 4.放射免疫分析法第2頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1 前言免疫化學(xué)法的發(fā)展概況：1950年，兩位美國免疫學(xué)家成功地用碘的放射性同位素標(biāo)記抗原，開創(chuàng)了放射免疫研究的先河。1959年，Yalow和Berson建立了胰島素放免分析測(cè)定糖尿病病人血漿中胰島素濃度，放射免疫分析法創(chuàng)立。兩人獲得諾貝爾獎(jiǎng)。60年代中期 ，固相抗體分離方法建立。第3頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一60年代末，創(chuàng)立了免

2、疫放射分析（IRMA），靈敏度、特異性和線性范圍均優(yōu)于RIA 。70年代初，建立了酶標(biāo)記免疫分析（EIA），其標(biāo)記物來源豐富，價(jià)格低，沒有放射性污染，有效期長，正常的保存期可超過一年。發(fā)展迅速。但由于要測(cè)定酶的活性，涉及酶動(dòng)力學(xué)，比較復(fù)雜且靈敏度不及RIA。70年代中期，首次報(bào)道用發(fā)光信號(hào)進(jìn)行酶免分析，靈敏度高，可達(dá)10-18mol，快速，發(fā)光信號(hào)信息量大。第4頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一80年代初，Ngot建立了熒光免疫分析(FIA)。90年代中期，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析，成為非放射性免疫分析中最有前途的方法。隨著物理化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與滲透

3、，新的標(biāo)記物和理化檢測(cè)手段還在不斷出現(xiàn)，從而推動(dòng)著免疫化學(xué)法向著更加專一，靈敏及測(cè)定自動(dòng)化的方向發(fā)展。 1968年，oliver等人首次用RIA測(cè)定體液中洋地黃毒苷，奠定了免疫化學(xué)法測(cè)定體液藥物濃度的基礎(chǔ)。 第5頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一發(fā)展至今，體內(nèi)藥分常用三大免疫標(biāo)記抗體技術(shù)為： 1.放射免疫分析 （radioimmunoassay，RIA）2.酶免疫分析 （enzyme immunoassay , EIA） 3.熒光免疫分析 （fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）第6頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 近年進(jìn)展

4、：第四免疫標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemolumminescence immunoassay, CLIA ） 該技術(shù)的應(yīng)用使免疫化學(xué)法在靈敏度和特異性兩方面得到進(jìn)一步發(fā)展,被認(rèn)為是很有前途的方法之一。第7頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.免化法的方法原理及特點(diǎn) 1 原理與方法2 方法特點(diǎn)第8頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1 原理與方法1.1 基本原理1.2 抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1.3 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1.4 免化法測(cè)定原理1.5 具體測(cè)定的方法第9頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析，即利用抗

5、原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，作競(jìng)爭(zhēng)免疫分析。1.1 基本原理第10頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一分析系統(tǒng)中三種基本成分 試劑中的標(biāo)記藥物（Ag*） 待測(cè)藥物 非標(biāo)記藥物（Ag） 藥物標(biāo)準(zhǔn)品 特異性抗體（Ab）第11頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 抗原抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這是由抗原與抗體分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。1.2 抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)第12頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的兩個(gè)階段第一階段 抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段。此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第13頁

6、，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第二階段可見反應(yīng)階段。Ag-Ab復(fù)合物在環(huán)境因素 (如電解質(zhì),PH,溫度,補(bǔ)體)的影響下,進(jìn)一步交聯(lián)聚合,表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng).此階段反應(yīng)較慢,需數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí).第14頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1.3 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 特異性 抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原決定簇與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點(diǎn)之間的結(jié)合。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)上的互補(bǔ)關(guān)系，所以呈現(xiàn)高度的特異性。 如同鑰匙和鎖的關(guān)系，一把鑰匙配一把鎖。但偶爾也會(huì)出現(xiàn)一把鑰匙開幾把鎖的情況，比如有些大分子的蛋白質(zhì)常常含有

7、多種抗原表位，如果兩種不同抗原分子上有相同的抗原表位，即可出現(xiàn)交叉反應(yīng)，也就是說同一抗體可結(jié)合不同抗原分子。 第15頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一抗原決定簇（antigenic determinant ） 是存在于抗原分子表面，決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，一般由58個(gè)氨基酸殘基、短寡糖殘基、核苷酸殘基組成。抗原決定簇是被免疫細(xì)胞和抗體分子識(shí)別的標(biāo)志，是免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。 第16頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第17頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一交叉反應(yīng)（Cross Reaction）由共同抗原刺激機(jī)

8、體產(chǎn)生的抗體分子可以和不同生物間相同或相似的抗原決定簇結(jié)合。 共同抗原(common antigen)兩種不同生物間存在相同或相似的抗原決定簇，稱為共同抗原。 第18頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一交叉反應(yīng)示意圖第19頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一可逆性 抗原抗體反應(yīng)遵循生物大分子熱動(dòng)力學(xué)反應(yīng)原則：第20頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一其反應(yīng)式為： k1為正反應(yīng)速度常數(shù)，k2為逆反應(yīng)速度常數(shù)，K是反應(yīng)平衡時(shí)的速度常數(shù)。由上式可知，K值是反映抗原抗體結(jié)合能力的指標(biāo)，所以抗體親和力通常以K值表示。第21頁，共136頁，

9、2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1.4 免化法測(cè)定原理第22頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 測(cè)定系統(tǒng)中，Ag*與Ab的量固定，Ag濃度，將抑制Ag*和Ab的結(jié)合，Ag*-Ab的數(shù)量，從而形成競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)，反應(yīng)體系中有兩種形式的標(biāo)記物存在，即游離的Ag*和復(fù)合物Ag*-Ab。根據(jù)標(biāo)記物的理化特性（如：放射性、光吸收、熒光等），采用一定的理化分析手段測(cè)定其中游離的（Ag*）或結(jié)合態(tài)的（Ag*-Ab）的標(biāo)記物濃度，間接求算被測(cè)藥物Ag的含量。（直接測(cè)定的是標(biāo)記物濃度）第23頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一RIA原理示意圖第24

10、頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第25頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第26頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1.5 具體測(cè)定的方法 固定Ag*和Ab的量，其他條件一定，標(biāo)記藥物的平衡濃度（Ag*或Ag*-Ab）與Ag加入量具有一定的相關(guān)性，通過測(cè)定一系列含已知加入量的Ag的標(biāo)準(zhǔn)管中標(biāo)記物的平衡濃度（Ag*或Ag*-Ab），求得Ag濃度與標(biāo)記藥物平衡濃度間的函數(shù)關(guān)系，（即通常定量中所謂標(biāo)準(zhǔn)曲線）。將含被測(cè)藥物Ag的樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管按相同條件操作，測(cè)定樣品管中標(biāo)記物的平衡濃度，利用函數(shù)關(guān)系（標(biāo)準(zhǔn)曲線）求得樣品中Ag的濃度。

11、第27頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2 方法特點(diǎn)2.1 靈敏度極高最低檢測(cè)濃度達(dá)10-910-12g/ml水平。原因： 選用對(duì)藥物具高度親和性的抗體用結(jié)合蛋白使含量極低的藥物被抗體牢固結(jié)合，易于檢出。 引入了能夠提供強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物，如：放射性同位素標(biāo)記,熒光標(biāo)記，酶標(biāo)記等，并采用高靈敏的理化手段檢測(cè)。第28頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 2.2 特異性（選擇性）較高 原因：選用的抗體對(duì)被測(cè)藥物具高度的專一性，能夠與被測(cè)藥物進(jìn)行選擇性的結(jié)合。說明：由于交叉反應(yīng)的存在，使免化法的特異性不如色譜法高。第29頁，共136頁，2022年，5月2

12、0日，18點(diǎn)8分，星期一2.3 所需樣品量少，且樣品前處理過程 簡單，常常不需要任何前處理。 第30頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.抗體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià) 1.抗體的制備 2.抗體質(zhì)量的評(píng)價(jià)第31頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1.抗體的制備 標(biāo)記物 三種基本試劑 抗體 藥物標(biāo)準(zhǔn)品（非標(biāo)記物） 抗體質(zhì)量的好壞直接影響到測(cè)定結(jié)果的靈敏度和精密度。任何免疫分析法都必須具備三種基本試劑，即：第32頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 1.1 從藥物半抗原制備抗原 兩個(gè)步驟 1.2 抗體的獲得 第33頁，共136頁，2022

13、年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1.1 從藥物半抗原制備抗原 半抗原（hapten）：分子量小于1000的物質(zhì)，需要與蛋白質(zhì)或多肽等載體物質(zhì)結(jié)合后，才能具有抗原性，并誘發(fā)特異性抗體。這類小分子物質(zhì)稱為半抗原。（臨床上使用的藥物大多數(shù)為半抗原）第34頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一從藥物半抗原制備抗原的兩個(gè)主要問題： 載體的選擇關(guān)鍵：應(yīng)使藥物與載體形成的結(jié)合物易溶解。最常用的載體：牛血清白蛋白(BSA)；兔血清白蛋白(RSA)優(yōu)點(diǎn)：價(jià)廉，免疫活性高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 溶解度好，連接基團(tuán)多。 第35頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 藥物與蛋白質(zhì)載

14、體的結(jié)合包括：a.結(jié)合位點(diǎn)b.結(jié)合方式c.每個(gè)蛋白分子所結(jié)合的藥物分子數(shù)目第36頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一a.結(jié)合位點(diǎn)蛋白質(zhì)到底連接到半抗原分子上的哪個(gè)位置？一般認(rèn)為，理想的人工抗原是使蛋白質(zhì)聯(lián)接在半抗原分子上對(duì)免疫識(shí)別最不重要的區(qū)域，也就是勿使半抗原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（免疫決定簇）被掩蓋。第37頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一b.結(jié)合方式藥物與載體蛋白的結(jié)合通常是通過共價(jià)鍵或配位鍵聯(lián)接。藥物本身有活性官能團(tuán)，如-COOH，-NH2，-OH，-C=O等，可采用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)試劑與蛋白結(jié)合；若藥物本身無適當(dāng)?shù)幕钚怨倌軋F(tuán)，可以經(jīng)化學(xué)處理使其產(chǎn)生活性基團(tuán)

15、，然后與蛋白結(jié)合，或?qū)⑺幬锝Y(jié)構(gòu)稍加改變，加入活性基團(tuán)后與蛋白結(jié)合。第38頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一c.每個(gè)蛋白分子所結(jié)合的半抗原分子數(shù)目載體蛋白分子上結(jié)合的半抗原數(shù)目常常影響誘發(fā)動(dòng)物抗體的產(chǎn)生，數(shù)目過多或過少，均可使誘發(fā)能力降低。一般每個(gè)蛋白質(zhì)分子上結(jié)合的半抗原分子以10個(gè)左右為宜。第39頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 1.2 抗體的獲得 將經(jīng)純化、凍干的藥物載體蛋白結(jié)合物懸混于弗氏完全佐劑 （Freunds complete adjuvant）中，配成1mg/ml的混懸液，用皮下或皮內(nèi)注射的方式注入免疫動(dòng)物體內(nèi)（常用家兔、山羊、豚鼠

16、），（也可采用股淋巴結(jié)直接注射），數(shù)月后可誘發(fā)得到所需抗體。當(dāng)免疫動(dòng)物血液中抗體達(dá)到一定量后，及時(shí)采血，分離血清（或血漿）。便可獲得能對(duì)特定藥物專一性結(jié)合的特異性抗體。第40頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.抗體質(zhì)量的評(píng)價(jià) 從三個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià): 2.1 特異性（specificity） 2.2 親和力（affinity） 2.3 滴度 （titer） 第41頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 2.1 特異性 （specificity） 抗體與標(biāo)記及非標(biāo)記藥物的結(jié)合能力（要求：對(duì)標(biāo)記及非標(biāo)記藥物有同等結(jié)合力，以便有效抑制） 抗體與同特定抗原相似

17、物質(zhì)的結(jié)合能力，即交叉反應(yīng)的程度（要求：抗體與標(biāo)記藥物的結(jié)合力不被交叉反應(yīng)所抑制） 第42頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 2.2 親和力（affinity） 用抗原抗體反應(yīng)常數(shù)K表示：K=Ag-Ab/AgAbK值大，親和力強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果的重觀性越好。一般K值達(dá)到109-1012mol/L 才適合用于放免分析。即抗體對(duì)抗原吸引力的大小及抗原抗體結(jié)合的牢固度。第43頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 2.3 滴度（titer） 即能與定量藥物產(chǎn)生一定程度結(jié)合的抗血清的最大稀釋度，是抗血清中抗體濃度的一種表達(dá)方式。稀釋倍數(shù)越大，表示滴度越高。在實(shí)際工

18、作中，多采用結(jié)合標(biāo)記抗原50%時(shí)的抗血清稀釋度，過高或過低都影響方法的靈敏度。第44頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一小 結(jié) 1.前言 四大標(biāo)記免疫技術(shù)第45頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.免化法的方法原理及特點(diǎn)1.基本原理2.分析系統(tǒng)中的三種基本成分3.抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)4.測(cè)定方法原理5.方法特點(diǎn)第46頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.抗體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià)1.半抗原2.抗體質(zhì)量評(píng)價(jià)的三個(gè)指標(biāo)第47頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一4.放射免疫分析法1 免疫化學(xué)法的分類 2 放射免疫分

19、析（RIA）定義3 RIA中的基本問題4 具體操作步驟 5 RIA的優(yōu)缺點(diǎn)第48頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2 放射免疫分析（RIA）定義(RIA測(cè)定的基本原理即競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析， 標(biāo)記藥物所用的試劑為放射性同位素)。根據(jù)放射性同位素檢測(cè)的高靈敏性以及Ag-Ab反應(yīng)的高度特異性，利用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體的一種超微量分析方法。第49頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 3 RIA中的基本問題3.1 抗體的制備3.2 標(biāo)記藥物的制備 3.3 結(jié)合標(biāo)記藥物與游離標(biāo)記藥物的分離3.4 放射性強(qiáng)度測(cè)定3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測(cè)定 第50頁，共

20、136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.2 標(biāo)記藥物的制備 a對(duì)同位素的要求 用作標(biāo)記藥物的放射性同位素，須有較高的放射性比度和純度，且標(biāo)記后的藥物保持原有的免疫活性和穩(wěn)定性。 第51頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一標(biāo)記抗原應(yīng)具備的條件： 比放射性高，以保證方法的靈敏度； 免疫活性好； 所用的核素的半衰期盡可能長，標(biāo)記一次 可較長時(shí)間使用，這對(duì)來之不易的抗原尤 其重要； 標(biāo)記簡便、易防護(hù)。第52頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一bRIA中常用的放射性同位素3H，14C，125I，131I, 75Se等(其中3H 和125I應(yīng)用最

21、多，且以125I應(yīng)用最廣泛)。125I標(biāo)記藥物的常用方法：氧化法常用氧化劑有H2O2，ICL，氯胺T 第53頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.3 結(jié)合標(biāo)記藥物與游離標(biāo)記藥物的分離 RIA屬非均相免疫分析，須將游離標(biāo)記物與結(jié)合態(tài)標(biāo)記物分離后才能測(cè)定各自的放射性強(qiáng)度。 *雙抗體法 固相法 吸附法 化學(xué)試劑沉淀法 常用的分離技術(shù)第54頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第55頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一游離藥物和結(jié)合藥物的分離方法分離方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)吸附法快速簡單，可批量處理樣品難以掌握好加入活性炭的時(shí)間，時(shí)間長了會(huì)使B分離

22、化學(xué)試劑沉淀法試劑價(jià)格低廉，操作方便F和B分離不夠完全，結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度低于吸附法和雙抗體法雙抗體法操作簡便，穩(wěn)定，可處理大量樣品，應(yīng)用廣泛。特異性。重現(xiàn)性好。要制備第二抗體增加了實(shí)驗(yàn)難度，且沉淀所需時(shí)間較長固相分離法操作簡便，易于自動(dòng)分析固相載體本身吸附游離標(biāo)記物，誤差較大第56頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 雙抗體法（double antibody method） 是分離B和F的一種有效的方法。一般的抗原抗體反應(yīng)中，生成的抗原抗體結(jié)合物因分子量小，不足以生成沉淀而處于“溶解”狀態(tài)。通常這種抗體叫做第一抗體，若將第一抗體再作為新的抗原注射入較大動(dòng)物（如羊、馬、

23、牛等），則可獲得第二抗體。第二抗體可以與第一抗體-抗原結(jié)合物形成相應(yīng)的結(jié)合物，使分子體積變大而形成沉淀，達(dá)到B和F的分離。 第57頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第58頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.4 放射性強(qiáng)度測(cè)定裝置通常采用液體閃爍計(jì)數(shù)器或醫(yī)用譜儀（計(jì)數(shù)器）。液體閃爍計(jì)數(shù)器價(jià)格昂貴，主要用于射線測(cè)定，（用3H，14C標(biāo)記的藥物，用此儀測(cè)定放射性強(qiáng)度）計(jì)數(shù)器較普及、便宜，用于射線測(cè)定，（125I， 131I標(biāo)記的藥物，用此儀測(cè)定）。第59頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第60頁，共136頁，2022年，5月2

24、0日，18點(diǎn)8分，星期一第61頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測(cè)定 平衡飽和法*（常用方法）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法順序飽和法（區(qū)別：加液順序不同） 第62頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一平衡飽和法 所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合，也不解離的平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測(cè)抗原、標(biāo)記抗原、抗體三者一起溫育。 加樣程序一般先加標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)樣品，再加抗血清，最后加標(biāo)記物。這樣的順序是讓標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)物與抗體有短暫的結(jié)合，提高抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制能力。 第63頁，共136頁

25、，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一順序飽和法 基本原理是先將標(biāo)準(zhǔn)物或血樣品與抗血清混勻，免疫反應(yīng)624h，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原，與抗體反應(yīng)1224h，最后分離B與F，這稱為順序飽和分析法。第64頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制過程 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 標(biāo)記藥物及其復(fù)合物的放射性強(qiáng)度測(cè)定 曲線繪制（采用半對(duì)數(shù)座標(biāo)繪圖法或雙 對(duì)數(shù)座標(biāo)繪圖法） 第65頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第66頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一說 明 因RIA中影響測(cè)定結(jié)果的因素較多

26、，因此， 每次測(cè)定樣品都需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即標(biāo)準(zhǔn) 曲線繪制與樣品測(cè)定是同時(shí)進(jìn)行的。第67頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 RIA主要采用商品化試劑盒測(cè)定 藥物標(biāo)準(zhǔn)品（Ag） 抗體（Ab） 經(jīng)過標(biāo)記的藥物（Ag*） 配制培育液、工作的試劑 我國現(xiàn)有商品化試劑盒已有幾十種可供選用。試劑盒配置第68頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第69頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第70頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一4 具體操作步驟 4.1 按試劑盒說明在一系列試管中按順序加入等量 的標(biāo)記藥物，不等量的被測(cè)藥物

27、的標(biāo)準(zhǔn)品和待 測(cè)藥物的液體樣品。4.2 向各管中加等量抗血清（Ab）4.3 加入特定的緩沖培育液，在一定溫度，pH條 件下培育一定時(shí)間，充分反應(yīng)達(dá)到平衡。第71頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一4.4 采用適當(dāng)分離方法，將Ag*和Ag*-Ab分離4.5 測(cè)定放射性強(qiáng)度：按標(biāo)準(zhǔn)藥物所含放射性同 種素種類來選擇儀器。4.6 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和被測(cè)藥物的含量的計(jì)算第72頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一5.1 優(yōu)點(diǎn)(1)靈敏度高(2)選擇性高(3)樣品需求量少，且不需預(yù)處理（簡單）(4)可用時(shí)進(jìn)行大批量的樣品測(cè)定 (5)準(zhǔn)確度和精密度較高，僅次于色譜法 R

28、SD10%5 RIA的優(yōu)缺點(diǎn)第73頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 5.2 缺點(diǎn)（1）不能同時(shí)測(cè)定藥物代謝產(chǎn)物，也不能同 時(shí)測(cè)定多種藥物（2）由于RIA是一種非均相免疫分析，給合 態(tài)和游離態(tài)藥物需先分離后才測(cè)定（3）放射性同位素對(duì)體有害（4）測(cè)定完以后的處理較麻煩第74頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一小 結(jié)1. 放射免疫分析的定義2. RIA中的基本問題3. 雙抗體法4. 平衡飽和法和順序飽和法5. RIA的操作步驟6. RIA的優(yōu)缺點(diǎn)第75頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 酶免疫分析（enzyme immunoas

29、say，EIA）是20世紀(jì)70年代在RIA基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫分析方法，是一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。用酶標(biāo)記抗原或抗體，用高活性的酶催化底物顯色或發(fā)光，具有特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，靈敏度可以和RIA相媲美的特點(diǎn)，并且避免了應(yīng)用過程中的同位素污染且標(biāo)記物穩(wěn)定、有效期長。 5.酶免疫分析法第76頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一EIA的分類一、非均相酶免疫分析（heterogeneous enzyme immunoassay） 二、均相酶免疫分析（homogeneous EIA） 第77頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一非均相酶免疫分析

30、1.競(jìng)爭(zhēng)性非均相EIA2.非競(jìng)爭(zhēng)性非均相EIA第78頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一競(jìng)爭(zhēng)性非均相EIA 酶標(biāo)記抗原（Ag-E）和待測(cè)抗原（Ag）共同競(jìng)爭(zhēng)包被在固相載體上的抗體（Ab），待測(cè)抗原量越多，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合影響到標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合量越少，經(jīng)分離除去游離的標(biāo)記抗原，與固相抗體結(jié)合的酶可以催化底物產(chǎn)生信號(hào)產(chǎn)物越少。 第79頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一非競(jìng)爭(zhēng)性非均相EIA 酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）是最為廣泛應(yīng)用的一種非競(jìng)爭(zhēng)性非均相的EIA，又稱 “夾心EIA”。 第80頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 特點(diǎn)

31、： 待測(cè)抗原與過量酶標(biāo)記抗體進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合，酶標(biāo)記抗體的結(jié)合量與待測(cè)抗原量 成正比（待測(cè)物也可為抗體，酶標(biāo)記抗原）； 使用固相分離技術(shù)，易于洗滌，減少干擾； 針對(duì)抗原結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)二個(gè)抗體，一為酶 標(biāo)記抗體，一為固相抗體，共同識(shí)別并將 待測(cè)抗原夾在其中； 這些特點(diǎn)保證了測(cè)定的高度特異性和靈敏度。 第81頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一均相酶免疫分析 通過酶標(biāo)記抗原（Ag-E）同抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物（Ag-EAb），改變了標(biāo)記酶的活性（增強(qiáng)或減弱），因此不需要將反應(yīng)系統(tǒng)中Ag-EAb與游離的酶標(biāo)記抗原Ag-E進(jìn)行分離，通過催化底物顯色反應(yīng)，測(cè)定酶活性變化，即

32、可推算出被測(cè)樣品中待測(cè)抗原的含量。第82頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 酶增強(qiáng)免疫分析(EMIT) （emzyme multipled immunoassay technique） 反應(yīng)體系中，待測(cè)抗原量越多，與抗體結(jié)合也多，使酶活性受到抑制的免疫復(fù)合物（Ag-EAb）越少，游離的Ag-E（具有酶活性）越多，催化底物Sb并產(chǎn)生信號(hào)產(chǎn)物就越多，因此稱之為“酶增強(qiáng)的免疫分析技術(shù)”。該方法由于不需要分離結(jié)合和游離的標(biāo)記抗原，可減少因物理分離而引起的誤差，操作簡便快速，便于自動(dòng)化；其靈敏度可達(dá)10-9mol/L，主要用于小分子半抗原藥物和小分子激素的測(cè)定。缺點(diǎn)是非特異性干擾

33、比較大，靈敏度不如非均相EIA。第83頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一標(biāo)記酶的選用原則 高純度、高比活、轉(zhuǎn)化速率高、特異性強(qiáng)； 酶蛋白分子上有足夠的偶聯(lián)基團(tuán)，使之能 連接到藥物上且所用的化學(xué)反應(yīng)不影響酶 的催化活力； 有較高的穩(wěn)定性；第84頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 測(cè)定酶活力的方法要簡單、靈敏、快速； 標(biāo)記酶在體液中應(yīng)不存在，以防干擾； 生物體液中應(yīng)無底物、抑制劑、干擾因 素等存在； 酶的來源、提純、供應(yīng)等應(yīng)方便、價(jià)廉。第85頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 目前常用的標(biāo)記酶有蘋果酸脫氫酶、已酰膽堿酯酶、6-

34、磷酸葡萄糖脫氫酶、過氧化物酶等。由于酶也是一種蛋白質(zhì)，因此標(biāo)記到藥物上的方式同制備抗原的連接方式類似，也是利用藥物分子上的羧基、氨基、羥基等與酶分子上的相應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。 第86頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1.ELISA的原理2.ELISA的類型3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑 結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備 4.對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷 ELISA知識(shí)簡介Enzyme linked immunosorbent assay第87頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 ELISA是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA） 。基礎(chǔ):抗原或抗體

35、的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.ELISA的原理第88頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.ELISA的類型 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體， 即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 第89頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原

36、此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。第90頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。第91頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.3 間接法測(cè)抗體 間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶

37、標(biāo)抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。第92頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。 第93頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。第94頁，共136頁，2022年，

38、5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.6 捕獲包被法測(cè)抗體該法主要用于傳染病早期診斷中IgM抗體的檢測(cè)。第95頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2.2.7 ABS-ELISA法 (生物素親和素放大法):固相支持物；:樣品；:特異性IgG； :生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；:辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；:DAB顯色液； :顯色；第96頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2

39、）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液第97頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一4 對(duì)照設(shè)定 陽性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。第98頁，共136頁，2022年，5月20日，18

40、點(diǎn)8分，星期一5 標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。第99頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一加 樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。基本操作注意事項(xiàng)第100頁，共136頁，2022年，5月20日

41、，18點(diǎn)8分，星期一保 溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。第101頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)

42、定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。第102頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一洗 滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。第103頁，共136頁，2022

43、年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一（1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：第104頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一顯 色顯色是酶催化無色

44、的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無色。第105頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一比 色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），

45、以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。第106頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一6 結(jié)果判斷 6.1 定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴

46、度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同。第107頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一6.2 定量測(cè)定ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平

47、坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。第108頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一6. 化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA) 發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新型超微量分析技術(shù)。這種方法兼具有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。 第109頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一化學(xué)發(fā)光免疫分析原理 1.免疫反應(yīng)系統(tǒng)兩個(gè)部分 2.化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng) 第110頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一其中: L為發(fā)光標(biāo)記物或發(fā)光底物,Ag為抗原, Ab為抗體,

48、Sp為固相。 第111頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 1.化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析 HRP標(biāo)記的CLEIA2.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 ALP標(biāo)記的CLEIA魯米諾or異魯米諾1，2二氧乙烷衍生物第112頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第113頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第114頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一第六章 放射受體分析法1.方法原理及特點(diǎn)2. RRA法中基本問題 3. RRA法實(shí)驗(yàn)裝置及操作步驟 第115頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一

49、1.方法原理及特點(diǎn) 放射受體分析： radioreceptor assay （RRA） 亦稱“放射性配基結(jié)合分析法” radioligand binding assay，(RLBA)第116頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一1方法原理： 基于競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析。 應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記配體，在一定條件下與相應(yīng)受體結(jié)合成配體受體復(fù)合物。由于二者的結(jié)合是配體和受體之間的生物活性而非免疫活性，因此具有更高的特異性。 放射受體分析可用于測(cè)定受體的親和常數(shù)、解離常數(shù)、受體結(jié)合數(shù)以及定位分析等。第117頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一分析系統(tǒng)中包括三種成分： （1）非標(biāo)記藥物Ag （2）標(biāo)記藥物Ag*（放射性配基） （3）特異性受體R 第118頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一 Ag和Ag*對(duì)受體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 第119頁，共136頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)8分，星期一2方法特點(diǎn)： 靈敏度高 特異性高 采用具有生理活性的受體R選擇性地結(jié)合 藥物 ,測(cè)定結(jié)果更符合藥物在體內(nèi)的實(shí)際 情況。 無須樣品預(yù)處理，所需樣品量少