1、06 細胞工程制藥S1 動物細胞制藥概述S2 動物細胞的培養技術S3 動物細胞制藥的前景S4 植物細胞制藥S1 動物細胞制藥概述細胞與細胞工程動物細胞工程應用于制藥細胞與細胞工程1665年，Hooke發現死細胞的細胞壁1674年，Leeuwenhoek首次觀察到活細胞1838 & 1839年，Schleiden & Schwann獨立提出了“細胞學說” 細胞工程的理論基礎細胞與細胞工程細胞工程：是以細胞為單位，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術，有目的地進行設計和操作，使細胞獲得新的遺傳特性，并在離體條件下進行大量培養和增殖，生產所需產品。動物細胞工程：就是指按照人們預定的設計，根據細胞生

2、物學及工程學原理定向改造動物細胞的遺傳性，并用于生產相關產品。細胞與細胞工程直接對細胞進行操作：1、細胞水平：細胞融合、胚胎移植、 單克隆抗體技術、細胞大規模培養技術 人工受精、試管嬰兒技術 2、亞細胞水平：核移植、細胞器轉移3、染色體水平：染色體轉移、改造4、基因水平：基因轉移、改造動物細胞工程應用于制藥1949年，Enders的一篇報告，為以后采用細胞培養技術生產疫苗奠定了基礎隨著基因工程的發展，人們認識到許多基因工程產物翻譯后的修飾、正確的切割、折疊的必要性，動物細胞成為一種重要的宿主細胞動物細胞工程應用于制藥目前，動物細胞已用于生產疫苗、干擾素、白細胞介素、EPO等各種基因工程藥物大腸

3、桿菌：表達的基因重組生物技術藥物有18種，都是結構相對簡單、分子量較小的蛋白質，主要為細胞因子類藥物。酵母：表達的基因重組生物技術藥物有8種，表達的蛋白可以正確折疊，分子量較大、結構較復雜。哺乳動物細胞：表達或生產的生物技術藥物有53種，都是分子量大、二硫鍵多、空間結構復雜的糖蛋白。動物細胞工程應用于制藥目前，動物細胞已用于生產疫苗、干擾素、白細胞介素、EPO等各種基因工程藥物美國FDA在2000年后批準的創新生物技術藥物，用大腸桿菌表達的產品只有4種，用酵母表達的只有2種，而通過動物細胞培養生產的產品則有22種。哺乳動物細胞已成為生物技術藥物最重要的表達或生產系統，這種局面仍將持續并且其所占

4、比例有逐年擴大趨勢。動物細胞工程應用于制藥另一個方向：轉基因動物制藥 （天然的生物反應器） 07轉基因動植物制藥S2 動物細胞的培養技術動物細胞的形態和生理特點生產用動物細胞的獲得動物細胞的培養條件動物細胞培養基動物細胞大規模培養的方法動物細胞的形態動物細胞的形態按照生長時的貼壁性，細胞可分為：貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞貼壁細胞貼附在支持物表面生長，需貼附因子1、成纖維樣細胞型（fibroblast-like cell type） 來源于中胚層組織的細胞如：成纖維細胞 心肌細胞 平滑肌細胞 成骨細胞貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞貼壁細胞呈梭形或不規則的三角形中央有圓形核胞質向外伸出2-3個突起

5、 細胞群常借助這些突起連接成網，生長時呈放射狀、漩渦狀或火焰狀貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞1、成纖維樣細胞型貼壁細胞貼附在支持物表面生長，需貼附因子2、上皮樣細胞型（epithelium-like cell type） 來源于外胚層和內胚層組織的細胞如：皮膚細胞 腸管上皮細胞 肺泡上皮細胞貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞貼壁細胞呈扁平的不規則多角形中央也有圓形核生長時彼此緊密連接成單細胞層貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞2、上皮樣細胞型貼壁細胞貼附在支持物表面生長，需貼附因子1、成纖維樣細胞型（FLC type） 2、上皮樣細胞型（ELC type）細胞形態不是絕對的，隨培養條件變化貼壁細胞懸浮細胞兼

6、性貼壁細胞懸浮細胞生長不依賴支持物表面，可在培養液中懸浮生長，細胞呈圓形例如：血液內的淋巴細胞、用于生產干擾素的Namalwa細胞等貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞兼性貼壁細胞不嚴格依賴支持物，貼附生長時：呈上皮或成纖維細胞的形狀懸浮生長時：呈圓形例如：中國倉鼠卵巢細胞（CHO）（chinese hamster ovary）貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞CHO-K1貼壁細胞懸浮細胞兼性貼壁細胞兼性貼壁細胞原代細胞二倍體細胞系轉化細胞系通過某個轉化過程形成異倍體轉化：自發（多見于嚙齒動物）、人工誘發（病毒或化學試劑）、利用腫瘤組織特點：具有無限增殖的能力，倍增時間較短，對培養條件和生長因子等要求較低，

7、更適合大規模工業化生產的需要S2 動物細胞的培養技術動物細胞的形態和生理特點生產用動物細胞的獲得動物細胞的培養條件動物細胞培養基動物細胞大規模培養的方法動物細胞的生理特點1、分裂周期長：12-48hG1期（DNA合成前期）：4-5hS期（DNA合成期）：6-8hG2期（DNA合成后期）：2-5hM期（細胞分裂期）：僅0.5-1h動物細胞的生理特點2、一般需貼附于基質，并有接觸抑制現象貼附生長：電荷作用、鈣鎂離子、貼附因子（如膠原、纖維結合蛋白）接觸抑制：在基質上分裂增殖，每個細胞都與其周圍的細胞相互接觸時，細胞就停止增殖；但是當細胞轉化為異倍體后，接觸抑制現象消失動物細胞的生理特點3、正常二倍

8、體細胞的生長壽命有限幾個概念原代培養：次代培養：直接從組織中分散的細胞進行培養將原代培養物轉移到新鮮培養基上培養動物細胞的生理特點3、正常二倍體細胞的生長壽命有限有限細胞系：無限細胞系： 由原代培養產生，只能進行有限的傳代，決定于細胞來源的種族和年齡 細胞經轉化后變成異倍體，具有無限增殖的能力，適合于工業化生產細胞系：由原代培養產生的、或轉化產生的細胞群動物細胞的生理特點4、對周圍環境十分敏感 對各種物理化學因素（如滲透壓、PH、離子濃度、剪切力、微量元素等）的變化耐受力很弱 原因：沒有細胞壁，影響脂質和蛋白質分子的因素都會影響細胞膜，并影響動物細胞的存活動物細胞的生理特點5、對培養基的要求高

9、 需要葡萄糖作為碳源、12種必需氨基酸、8種以上維生素、多種無機鹽和微量元素 需要多種細胞生長因子和貼壁因子等才能生長，且隨細胞種類的不同而不同動物細胞的生理特點6、蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同游離核糖體胞內蛋白粗糙內質網核糖體胞外或膜蛋白， 且多經糖基化S2 動物細胞的培養技術動物細胞的形態和生理特點生產用動物細胞的獲得動物細胞的培養條件動物細胞培養基動物細胞大規模培養的方法生產用動物細胞的獲得原代細胞二倍體細胞系轉化細胞系原代細胞直接取自動物組織、器官制成細胞懸液不能完全形成單細胞，且某一組織常由多種細胞組成生產中需要大量的動物，費錢，費勞力常用：雞胚細胞、兔腎或鼠腎細胞、血液淋巴

10、細胞二倍體細胞系從原代細胞純化出一定的細胞株具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制的特性有限的增殖能力，50代無致瘤性一般均從動物的胚胎組織中獲得，如： WI-38、MRC-5、2BSMRC-5轉化細胞系通過某個轉化過程形成異倍體轉化：自發（多見于嚙齒動物）、人工誘發（病毒或化學試劑）、利用腫瘤組織特點：具有無限增殖的能力，倍增時間較短，對培養條件和生長因子等要求較低，更適合大規模工業化生產的需要常見：Namalwa、CHO-K1、BHK-21、VeroCHO-K1BHK-21uninfectedinfectedS2 動物細胞的培養技術動物細胞的形態和生理特點生產用動物細胞的獲得動物細胞的培養條件動物細

11、胞培養基動物細胞大規模培養的方法動物細胞的培養條件1、器材的清洗和消毒2、保證良好的水質3、PH值去除有害因子，防污染經特殊處理最適為7.2-7.4；使用緩沖體系動物細胞的培養條件4、滲透壓5、溫度6、空氣最適290-300mOsm/kg；NaCl調節；平衡鹽最適370.5oC足夠的氧氣；常采用不同比例的O2、N2、CO2和空氣S2 動物細胞的培養技術動物細胞的形態和生理特點生產用動物細胞的獲得動物細胞的培養條件動物細胞培養基動物細胞大規模培養的方法動物細胞培養基天然培養基合成培養基無血清培養基天然培養基早期階段：多采用天然培養基常用：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等缺點：1、培

12、養基成分復雜，組分不穩定，2、來源有限因此不適合大量培養和生產的需要合成培養基1950年，Morgan等首先采用成分明確的化學試劑配制培養基，開創了合成培養基的研究使用階段優點：成分明確，組分穩定，可大量生產供應組成：糖類、氨基酸、維生素、無機鹽、核酸前體等尚需添加成分：動物血清（如5-10%的小牛血清）合成培養基可能的機制：1、提供有利于細胞生長所需的各種生長因子和激素2、提供有利于細胞貼壁所需的貼附因子和延伸因子3、提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結合蛋白4、提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素5、提供良好的緩沖體系無血清培養基無血清培養基：在合成培養基（未添加動物血清）內加入不同種類

13、的添加劑：1、激素和生長因子：如胰島素促進糖原和脂肪酸合成，并刺激細胞生長2、結合蛋白：如鐵傳遞蛋白和白蛋白；為了便于純化，可改用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵3、貼附因子和延伸因子4、其他有利于細胞生長的因子和元素無血清培養基無血清培養基的優點：1、提高了細胞培養的可重復性，避免了由于血清批次間差異的影響 2、減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染 3、避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性 4、減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結果的分析5、供應充足、穩定，產品易于純化 S2 動物細胞的培養技術動物細胞的形態和生理特點生產用動物細胞的獲得動物細胞的培養條件動物細胞培養基

14、動物細胞大規模培養的方法動物細胞大規模培養的方法懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養懸浮培養適用：所有非貼壁依賴性細胞和兼性貼壁細胞優點：操作簡便，培養條件比較均一，傳質和傳氧較好，容易擴大培養規模，在培養設備的設計和實際操作中可借鑒許多有關細菌發酵的經驗不足：細胞密度較低懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養懸浮培養設備：通氣攪拌罐式生物反應器懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養類似于細菌發酵罐，但由于動物細胞的特性，具體要求又有所不同：1）低速攪拌：20-100rpm2）高徑比小：1-1.5 ：1 （微生物：2-3：1）3）無氣泡通氣系統懸浮培養設備：氣升式生物器（Airlift Bioreactor）懸浮培

15、養貼壁培養貼壁-懸浮培養懸浮培養設備：攪拌瓶（spinner flask） 簡易的實驗室規模，最大10L懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養小常識：培養規模的劃分實驗室規模（lab scale）中試規模（pilot scale）生產規模（industrial scale）100L：生產和提供產品這種劃分不是絕對的，還需根據細胞的產量和臨床用藥劑量的大小而定。貼壁培養適用：所有貼壁細胞和兼性貼壁細胞優缺點恰好與懸浮培養相反 貼壁培養與懸浮培養的一個重要不同：傳代或擴大培養時，常需要用酶使細胞間質和一些貼附因子水解，使細胞從基質分離成單細胞。懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養細胞密度高；操作復雜貼壁培養懸浮

16、培養貼壁培養貼壁-懸浮培養 設備：轉瓶（roller bottle） 早期大量培養原代雞胚或腎細胞生產疫苗， 后來引入了計算機自動控制。貼壁培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養 設備：轉瓶（roller bottle）貼壁培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養 設備：固定床式生物反應器（fixed bed bioreactor）（hollow-fiber bioreactor）貼壁培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養 設備：中空纖維式生物反應器（membrane bioreactor）貼壁培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養 設備：膜式生物反應器10個內腔，每個表面積600cm22L培養液 = 6000

17、cm2的轉瓶，12.5L聚苯乙烯，可隨意處理懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養貼壁培養 設備：Cell factory由圓柱形陶瓷基質套筒構成，內含許多1mm2正方形體腔，可用面積達0.4-12.5m2，放大面積可達210m2懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養貼壁培養 設備：Opticell貼壁-懸浮培養貼壁-懸浮培養，又稱假懸浮培養，主要是為了結合懸浮培養和貼壁培養的優點而避免其不足。懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養懸浮培養：操作簡便，細胞密度低貼壁培養：操作復雜，細胞密度高貼壁-懸浮培養貼壁-懸浮培養，又稱假懸浮培養，主要是為了結合懸浮培養和貼壁培養的優點而避免其不足。微載體培養包埋（或微囊）培養結

18、團培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養微載體培養1967年，荷蘭的van Wezel首先采用葡聚糖Sephadex A50微小顆粒培養貼壁細胞獲得成功1980S已被正式用于工業化生產各種疫苗和其他細胞產品，并出現了一大批商品化的微載體（microcarrier）。懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養微載體培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養微載體培養1980S后期，又開發出多孔微載體（或稱多孔微球），極大地增加了供細胞附著的比表面積，且適用于懸浮培養。懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養微載體培養加入鈦等金屬增加比重 適用于固定床反應器不加鈦比重輕 可用于通氣攪拌罐式生物反應器、氣升式生物反應器。懸浮培養貼壁

19、培養貼壁-懸浮培養微載體培養理想的微載體：1、表面性質與細胞有良好的相容性，適于細胞附著、伸展和增殖2、材料無毒性，對細胞、人體3、材料惰性，不與培養基成分發生化學變化，也不吸收營養成分4、材料軟性，避免在攪拌中損傷細胞5、比重適中，在1.030-1.045g/ml，在低速攪拌下就可懸浮，而靜止時又很快沉降，便于換液和收獲懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養微載體培養理想的微載體：6、粒徑溶脹性均一， 在60-250m之間，差異不大于20m，有利于細胞均勻地分布在各微載體表面7、具有良好的光學透明性，適于在倒置顯微鏡下觀察細胞在載體上的生長情況8、可耐120高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌9、經簡單處理后

20、可反復使用多次10、原料充分，制作簡便，廉價懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養包埋（或微囊）培養細胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊中早期主要用于固定細菌和酵母等，廣泛應用于工業生產和環境保護中，后來才被移植于動植物細胞的培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養包埋培養用于包埋細胞的材料人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、環氧樹脂多糖：纖維素、瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈣等蛋白質：膠原、明膠、纖維蛋白等目前最普遍實用的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠控制溫度或離子種類可來改變材料的物相懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養微囊培養微囊培養在包埋培養的基礎上發展而來微囊的制備：在形成凝膠后，用另一種電荷相反的材料與

21、之作用，使在載體外形成一層聚合膜，然后再使膜內的載體液化目前，使用最多、最成熟的材料搭配是海藻酸鈉-聚賴氨酸。 懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養包埋（或微囊）培養優點：1、細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害2、可獲得較高的細胞密度 107-108cells/ml3、控制微囊膜的孔徑可使產品濃縮在微囊內，有利于下游產物的純化4、可采用多種生物反應器進行大規模培養懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養結團培養1980年，Tolbert首先利用有些正常需要貼附在基質表面的細胞有形成結團的特點，用攪拌式反應器和灌流培養的方式獲得了高密度的細胞實質：用細胞本身作為基質，相互貼附后，再用懸浮的方法進行培養如何促進結

22、團：在培養基內加入有些直徑較小的顆粒，促使細胞先附著其上后再相互附著優點：載體用量少，細胞不能在載體上伸展，細胞呈球形；操作簡便，節省了用于微載體的成本懸浮培養貼壁培養貼壁-懸浮培養S3 動物細胞制藥的前景提高產量降低成本改進質量轉基因動物組織工程 07轉基因動植物制藥提高產量降低成本改進質量組織工程提高產量首要的是提高表達水平鼠骨髓瘤細胞生產IgG 5pg/cellmin10L反應器培養，細胞密度為107/ml， 理論上720g/d，實際卻只有1g/d主要原因：不了解細胞在體外調控基因表達的機制提高產量降低成本改進質量組織工程提高產量雜交瘤細胞中加入IPSF-I/-II： 產量可增加20倍I

23、mmunoglobulin production stimulating factor如何提高表達水平，還存在著很大的潛力提高產量降低成本改進質量組織工程提高產量在同一種CHO細胞中，所表達尿激酶原的產量，在幾種不同的表達載體之間存在著很大的差異。鼠白血病病毒啟動子載體 表達量高達100g/106d提高產量降低成本改進質量組織工程降低成本1、提高細胞的表達水平2、改進培養基配方，盡可能利用廉價原料 如：用蛋白胨取代昂貴的生長因子3、改變細胞的代謝途徑（“代謝工程”）Bird:宿主細胞內導入谷氨酰胺合成酶基因，培養基中就不需加谷氨酰胺Pak:超級CHO（已轉入胰島素樣生長因子基因、鐵傳遞蛋白基因

24、），可直接培養于無血清培養基中，而無需另加這些因子。提高產量降低成本改進質量組織工程改進質量主要是指糖基化質量問題糖基化的有無和正確與否直接關系到藥效、藥代動力學和免疫原性如：非糖基化EPO在體內沒有生物活性 大腸桿菌生產的CSF會引起抗體的產生提高產量降低成本改進質量組織工程改進質量細胞種屬不同，糖基化質量也不同昆蟲表達系統產量最高 但是糖基化的種類與天然產品相差很大 因此，雖有300多種產品表達成功，但只有個別產品被批準應用于臨床。提高產量降低成本改進質量組織工程改進質量如何改進質量？1、“糖基化工程”：人為地改變細胞的某些酶基因，改進和控制培養條件，達到產物正確糖基化的目的。如：在CHO

25、細胞中表達IFN-時共轉染-2,6-唾液酸轉移酶基因，可提高唾液酸化程度2、應用人類的細胞作為宿主細胞： 如：Namalwa細胞表達t-PA、EPO等所得產品的糖基化與天然產品完全一樣。提高產量降低成本改進質量組織工程組織工程組織工程：通過對細胞的大量培養，并用細胞直接作為一種治療手段用于臨床，或者用培養的細胞進一步加工構成一種組織，并用于臨床治療。胰島細胞糖尿病胎兒中腦細胞帕金森病成肌細胞杜興肌營養不良癥基因治療：細胞治療人造皮膚人造骨骼人造肝臟人造胰腺人造血管S4 植物細胞制藥植物細胞工程是指定向改造植物細胞遺傳性，利用植物細胞生產有用物質的技術。目前應用最廣的有三方面內容：1、植物的無性快速繁殖及育種2、細胞大量培養及生產藥用成分（次生代謝物生產）3、轉基因植物S4 植物細胞制藥“回歸自然”，開發植物藥物30