1、關于細胞凋亡與免疫第一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月2引言細胞凋亡是一種普遍存在的生物學過程 ，它與細胞增殖、細胞分化都是最重要的生命現象，正是由于細胞增殖、細胞分化、細胞調亡的相互聯系、相互制約的關系，才保證了生物體的正常發育。正常凋亡過程受阻或某種原因所致不正常的細胞凋亡，都會使機體出現病癥。因此對細胞凋亡的研究有助于某些疾病的闡明與治療。 細胞凋亡的研究是近年來生命科學中發展起來的熱點課題。早期基于形態學和生物化學，近期則是基于分子生物學技術從基因調控、信號轉導等方面研究。第二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月3主要內容細胞凋亡概述（基本概念、意義、生物學特征、調

2、節、信號傳遞等）細胞凋亡與免疫生理細胞凋亡與免疫病理細胞凋亡的檢測方法細胞凋亡研究相關展望第三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月一細胞凋亡概述1. 基本概念及生物學意義：凋亡（apoptosis）一詞于1972年Kerr（英國阿伯丁大學病理學教授）引入，是一個希臘語合成詞,原意指花瓣或樹葉的自然脫落（Apo脫落ptosis飄零=Apoptosis）。基本概念：細胞凋亡是一個“形態學”概念，是對細胞超微結構觀察的基礎上得出的特指一種由基因控制、形態學特征與壞死截然不同的自主性細胞死亡方式。第四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月1972年，Kerr,Wylle和Curry在許多

3、正常組織中觀察到一種與經典的細胞壞死形態特征不同的現象：細胞收縮、細胞碎片、散在不完整細胞等，據此，他們首次提出apoptosis一詞。國內常譯為細胞凋亡、細胞凋落、細胞凋謝、細胞衰亡等，多數學者傾向于“細胞凋亡”。強調這一過程是一種自然的生理學過程。第五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月6 細胞凋亡與細胞程序性死亡細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） PCD最初是1956年發育生物學中提出的概念，是個功能性概念，一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發育中的一個預定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。 細胞凋亡和程序性死亡

4、具有非常密切地關系。大多數情況下程序性細胞死亡是以凋亡的方式進行，但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式。第六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月如煙草蛾節間肌肉細胞、哺乳動物某些神經元和紅細胞，它們的程序性死亡是以非凋亡的方式進行。有時由外源性理化因子刺激誘發的細胞死亡，形態上似凋亡，但并不是由細胞內原裝程序所引發，也不能稱為程序性細胞死亡（如放療后腫瘤組織壞死等）。因此細胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式。 細胞凋亡與細胞程序性死亡第七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月8細胞凋亡的生物學意義： 近年來對細胞凋亡的研究日漸重視，現代研究結果表明：細胞凋亡不僅是認識細胞死亡過程

5、的基礎，而且在胚胎發育、造血、免疫、乃至腫瘤形成中都有極為重要的作用。1. 確保正常的生長發育(development )：清除無用、多余的細胞。2. 維持內環境穩定(maintenance of homeostasis) ：清除受損、突變或衰老的細胞。3. 發揮積極的防御功能(defense reaction)：清除病毒感染細胞等對機體有害的細胞。第八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月 Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis. Tissue remodeling. 第九張，PPT共一百零二頁，創作于

6、2022年6月 The resorption of the tadpole tail at the time of its metamorphosis into a frog occurs by apoptosis. Elimination of transitory organs and tissues. 第十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月第十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月細胞凋亡參與皮膚更新第十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月第十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月142. 細胞凋亡的生物學特征形態學變化生物化學變化 胞內Ca+濃度增高

7、 DNA片段化 大分子的合成(凋亡相關蛋白質及RNA合成）tTG（組織轉谷氨酰胺酶）的積累并達到較高的水平。 一種依賴鈣離子的酶，當凋亡起始時，Ca+濃度上升，從而使tTG活化。其作用是保持凋亡小體的完整性，防止有害物質的逸出。第十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月15Morphological Changes (細胞生物學詳講)第一階段：胞體縮小與周圍細胞失去聯系，細胞器變致密，核體積縮小，核仁消失，染色質濃集于核膜內表面下，形成新月形致密小塊。第二階段：染色體斷裂，核膜與細胞膜均內陷，包裹胞內成分(胞漿、細胞器、碎裂的染色質及核膜)形成“泡”樣結構，此為“凋亡小體”。最后，整個

8、細胞均裂解成這種“小體”。第三階段：凋亡小體被鄰近的巨噬、上皮細胞等識別、吞噬、消化。上述三個階段維持時間很短，通常在幾分鐘、十幾分鐘內即可完成。第十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月16細胞凋亡時的形態學變化第十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月 細胞凋亡與細胞壞死特征 細胞凋亡 細胞壞死誘導因素 生理及弱刺激 強烈刺激受累范圍 單個細胞丟失 成群細胞死亡膜完整性 保持到晚期 早期即喪失細胞體積 減少、固縮 增大腫脹染色質 凝聚成半月形 稀疏成網狀細胞器 無明顯變化 腫漲破壞溶酶體 保持完整 破壞外溢細胞形狀 形成凋亡小體 破裂成碎片基因組DNA 有控降解 隨機降解大

9、分子合成 一般需要 不需要基因調控 有 無后果 不引起炎癥反應 引起炎癥反應意義 生理死亡方式 病理死亡方式17第十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月18第十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月19第十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月20DNA ladderDNA fragmentationchromatinDNAcore histonenucleosome 180bpendonucleolytic第二十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月213. 細胞凋亡的誘導和抑制因素物理性因子，包括射線（紫外線， 射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等；

10、化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF）等。DNA和蛋白質合成的抑制劑等。第二十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月224.免疫相關的凋亡信號轉導接受凋亡信號凋亡調控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級聯反應第二十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月23免疫相關的凋亡信號途徑死亡受體介導的信號途徑線粒體途徑顆粒酶B途徑(CTL特有)第二十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月24死亡受體通路、線粒體通路第二十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月25其中膜受體和線粒體途徑均通過激活含半胱氨酸的天

11、冬氨酸酶（Caspase）剪切胞內底物（ Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程），導致凋亡特有的生化和形態學改變。細胞凋亡涉及的共同通路第二十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月26Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases的詞頭) 細胞凋亡涉及的共同通路第二十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月27第二十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月28Caspase家族的結構與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：I

12、CE是單核細胞來源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用； Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11 Caspase12，Caspase13， Caspase14。凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶（上游Caspase）：Caspase8， Caspase2， Caspase 9，Caspase10。凋亡效應亞類Caspase蛋白酶（下游Caspase）：Caspase3， Caspase6， Caspase7第二十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月29Caspase家族的特點：以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和異源活化,活化后形成四聚

13、體的蛋白水解酶，發揮生物學作用C端同源區存在半胱氨酸激活位點 第二十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月30 Caspase活化機制： Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，雖然分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體, 第三十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月31第三十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月32凋亡細胞的特征性表現：包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質濃縮，細胞膜活化，細胞皺縮，最后形成由

14、細胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細胞所吞噬。破壞細胞抗凋亡因素破壞細胞結構影響核酸的結構與功能 Caspase的效應機制第三十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月33破壞細胞抗凋亡因素正常活細胞內核酸酶處于無活性狀態。這是由于核酸酶和抑制物結合在一起（如抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化）。現知caspase可以剪切裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物稱為ICAD。有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性，因而

15、ICAD對CAD的活化與抑制是必需的。 第三十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月34破壞細胞結構Caspase可直接破壞細胞結構：如裂解核纖層核纖層（Lamin）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結構，使染色質（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質的固縮。第三十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月35影響核酸的結構與功能Caspase可作用于多種與DNA、RNA功能有關的蛋白：如滅活或下調與DNA修復有關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交

16、聯蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細胞的增殖與復制受阻并發生凋亡。第三十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月364.1 死亡受體的信號轉導(1).參與死亡受體信號轉導的接頭蛋白： （死亡結構域蛋白death domain protein）TRADD：TNF受體相關死亡結構域蛋白TNF+TNFRI（死亡結構域）+ TRADD細胞凋亡FADD：Fas相關死亡結構域蛋白FasL+Fas （死亡結構域） +FADD 細胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結構域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結構域蛋白第三十六張，PPT共一百零二頁，創

17、作于2022年6月37(2).死亡受體通路受體多聚化和構像改變死亡受體/配體/FADD/Caspase8或10+FADDFASL+FAS凋亡誘導復合物（DISC）胞質中游離的caspase8聚集到這個復合物上細胞有足夠caspase8 細胞caspase8濃度不夠死亡受體活化，細胞凋亡切割Bid tBid從胞質到線粒體 CtyC 釋放線粒體途徑第三十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月38FasL/Fas第三十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月39(3).死亡受體途徑的調控機制FLIPFADD-like-IL-1-converting-enzyme(FLICE) inhi

18、bitory protein近年發現的含DED的凋亡抑制蛋白廣泛存在于真核生物、哺乳動物細胞和病毒中包括：病毒基因編碼的FLIP(v-FLIP) 細胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPL功能：抑制Caspase8結合到DISC上，從而抑制起始Caspase激活。第三十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月404.2 線粒體途徑(1).基本環節：釋放caspase活化因子細胞色素C：細胞色素C+Apaf-1+ caspase9凋亡體AIF（凋亡誘導因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子第四十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月41(2).線粒體

19、通路第四十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月42(3).線粒體通路的調控機制Bcl-2家族（B cell lymphoma/leukemia-2）因該家族成員可通過改變外膜通透性而調控線粒體活化，故該途徑也稱為Bcl-2介導的線粒體途徑。 Bcl-2家族已發現15個成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個或多個BH結構域。第四十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月43根據結構和功能分為兩類：抗凋亡/促增殖成員：包括 Bcl-2、 Bcl-xl 等。機制：可阻止線粒體外膜通透化，從而阻止細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡。促凋亡成員：包括Bid、Bim、Bad等“BH3only”

20、蛋白質和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白質機制：影響APAF1的功能 影響線粒體的結構與功能第四十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月44第四十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月45第四十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月46 IAP（inhibitor of apoptosis，細胞凋亡抑制因子） IAP超家族的成員較多，共同的特征是含有一個或多個個氨基酸的重復序列（BIR），類似于zinc指狀的結構。BIR功能域和之間的連接區域介導對caspase的抑制作用，而環指狀結構則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導caspase-和-的泛素化降解作用。 第四十

21、六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月47第四十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月48(3) Smac/Dablo 在細胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進入細胞質。 成熟的Smac蛋白產生一個新的N基端,這個N基端的前面4個氨基酸可以與lAP的BIR結構域結合。 Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結合。Smac 與BIR2的結合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制，促進凋亡。 第四十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月49(4) AIF(apoptosis-inducing factor) Endo G 兩者均由線粒體釋放，可以非Caspase依賴方式介導染色

22、質的濃集和DNA片段化，促進凋亡。第四十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月50 顆粒酶B途徑凋亡顆粒酶B屬絲氨酸蛋白酶可作用于底物的天冬氨酸殘基位點是CTL殺傷靶細胞的主要效應分子。機制:(1)顆粒酶B直接剪切并激活Caspase-3,后者作用于胞內底物介導凋亡 (2)顆粒酶B剪切Bid而產生tBid,后者與Bax轉位于線粒體，介導細胞色素C釋放，激活Caspase級聯反應。第五十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月51細胞凋亡發生于在淋巴細胞分化、發育成熟及增殖和行使免疫學效應的全過程中；細胞凋亡在免疫系統成熟、受體多樣性選擇以及免疫自穩等方面均有重要作用；研究免疫系統凋

23、亡機制將為探討包括腫瘤、自身免疫病、艾滋病等免疫相關疾病的發生機理進而發展有效的防治方案提供依據。二細胞凋亡與免疫生理第五十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月52二細胞凋亡與免疫生理1.細胞凋亡與T細胞（1）凋亡與T細胞在胸腺的分化發育：第五十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月53（2）凋亡與成熟T細胞：活化T細胞表面高表達fas及fasL。AICD1.細胞凋亡與T細胞第五十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月542.細胞凋亡與B細胞（1）凋亡與骨髓中B細胞發育：（2）凋亡與成熟B細胞第五十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月553.細胞凋亡與淋巴細

24、胞的細胞毒作用： 有胞毒作用的淋巴細胞主要有CTL、NK、LAK細胞等。它們產生效應的機制相似：Ca+內流釋放穿孔素6-16nm孔靶細胞死亡 靶細胞凋亡 顆粒酶（絲氨酸酶）激活caspaseTNF相關蛋白 Tc高表達FasL第五十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月三細胞凋亡與免疫病理細胞凋亡不足及細胞凋亡過度都會造成疾病2004 0481proliferationapoptosishomeostasis time 第五十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月57與凋亡不足有關的疾病 與凋亡過度有關的疾病1 腫瘤 1 AIDS濾泡型淋巴瘤 2 神經變性疾病激素依賴性腫瘤（乳瘤

25、） 巴金森氏病2 自身免疫病 色素性視網膜炎系統性紅斑狼瘡 3 再生障礙性貧血免疫介導的腎小球腎炎 4 缺血性損傷3 病毒感染 心肌梗死，中風皰疹病毒，腺病毒 5 酒精中毒性肝病57凋亡不足與過度并存：動脈粥樣硬化（內皮細胞凋亡過度，血管平滑肌細胞凋亡不足）第五十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月58針對疾病種類的不同，可以通過抑制或者增強細胞凋亡的措施治療有關的疾病：1 誘導細胞凋亡治療因凋亡受抑而致的疾病放療和化療能激活腫瘤自殺程序，導致瘤細胞凋亡。改變細胞凋亡狀態用于疾病治療的許多措施尚屬試用階段。一個十分誘人的設想是基因治療通過載體導入凋亡相關基因干預細胞的凋亡調控來實現。

26、2 抑制細胞凋亡治療因凋亡過量而致的疾病神經生長因子治療神經系統退行性病變，可以延緩神經元凋亡。第五十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月59四細胞凋亡研究方法形態學方法生物化學方法免疫學方法組織化學方法分子生物學方法第五十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月60第六十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月611.形態學方法1）光學顯微鏡觀察樣品涂片或組織切片經常規處理、HE 染色后,即可放在油鏡下觀察。該方法簡便,缺點是只有在發現了具有特征性的凋亡小體時才能確定為熒光結果陽性,因而不易檢出早期的凋亡細胞,而且某些類型的細胞壞死(如凝固性壞死) 與細胞凋亡形態相似,兩

27、者不易區分。因此,該方法只能作為細胞凋亡初步推測的手段。第六十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月62第六十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月631.形態學方法2）熒光顯微鏡觀察：熒光染料吖啶橙(AO) 、碘化丙啶(PI) 、溴化乙錠(EB) 等染色,在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細胞的細胞核改變和凋亡小體的形成。這種方法適用于對體外培養細胞懸液的檢測,組織脫蠟切片經RNA 酶作用后也可用此法染色觀察。熒光顯微鏡檢查法方便易行,現已成為細胞凋亡檢查的常用手段。第六十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月64 On this slide the easiest and

28、historically first way of identifying apoptotic cells is shown. In this assay the blue fluorescent dye DAPI(4,6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride) has been used, which specifically stains DNA. 第六十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月651.形態學方法3）透射電子顯微鏡觀察： 凋亡細胞在電子顯微鏡下可見細胞體積變小,細胞質濃縮,內質網、線粒體增多,細胞膜微絨毛消失、起泡、出芽、形

29、成凋亡小體。超微結構觀察是診斷細胞凋亡最可靠的方法。 但該法只能定性,不能定量,而且觀察到凋亡小體的幾率也不高,在體內試驗時,凋亡小體可能很快被巨噬細胞吞噬清除,而不易觀察到;此外,用電子顯微鏡檢測細胞凋亡,樣品制備步驟繁瑣、耗時、昂貴。第六十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月66第六十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月671.形態學方法4）共聚焦激光掃描顯微鏡檢測： 共聚焦激光掃描顯微鏡是20 世紀80 年代發展起來的一種新型儀器,是在熒光顯微鏡的基礎上加裝了激光掃描裝置,利用計算機進行圖像處理,使紫外光和可見光激發熒光探針,從而得到清晰的細胞內部結構。該方法能用于細

30、胞的形態學分析,而且還能對凋亡細胞內的大分子進行定位。第六十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月682.生物化學方法：（1）典型的細胞凋亡顯示出DNA梯形電泳圖譜：細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮,染色質DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180200 bp 長的DNA片段或整數倍的寡核苷酸片段。凋亡細胞經處理后,采用常規方法分離提純DNA ,進行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜,而壞死細胞電泳后呈模糊的涂片狀第六十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月69細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖1細胞色素c誘導0 h2細胞色

31、素c誘導1 h3細胞色素c誘導2 h4細胞色素c誘導3 h5細胞色素c誘導4 h6陰性對照7Marker （ 自趙允、翟中和）第六十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月70第七十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月712.生物化學方法：（2）原位末端轉移酶標記技術： 凋亡細胞由于內源性核酸內切酶的激活，核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(缺口)，暴露出大量3末端，如用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)將標記的-dUTP進行缺口末端標記，則可原位特異地顯示出凋亡細胞。第七十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月722.生物化學方法： 由DNA 片

32、段末端標記技術發展而成的TUNEL 法 termina deoxy nucleotibyl transferase( TdT )-mediated dUTP-biotin nick end labelling ,TUNEL 及試劑盒化,使細胞凋亡的原位檢測在諸多領域的研究中得到廣泛應用。第七十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月73TUNEL法原理1.細胞凋亡其斷裂DNA斷端3-OH 暴露(壞死細胞DNA 斷裂是無規則的,其中也有少數可出現3-OH 的暴露,但數量極微弱,不易檢測出來) ;2.在末端DNA 轉移酶(TdT) 的作用下,在無需模板的情況下,可進行3端的DNA 合成;3.

33、如果在反應體系中加入標記的DNA ,則在3端出現一段帶有標記物的寡核苷酸,通過熒光顯示或其他顯色反應,可以原位地較特異地顯示發生凋亡的細胞。第七十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月74TUNEL法優點: 特異性:該法用生化方法特異地標記凋亡細胞,可以將凋亡細胞、壞死細胞和活細胞區分開來。凋亡細胞顯示增強的熒光,而壞死細胞和活細胞均不著染熒光。敏感性:TUNEL 法可用于只有極少細胞發生凋亡的情況。可定量檢測細胞凋亡。第七十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月75TUNEL法優點:適用于形態研究:用TUNEL 法標記細胞可動態觀察凋亡細胞的超微結構變化。適用性較廣:可用于石

34、蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離細胞的凋亡情況檢測。TUNEL法檢測快速,其反應過程僅需3h。第七十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月76第七十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月77第七十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月78缺點:只能標記中期及晚期的凋亡細胞。不能檢測只發生DNA 大片段(300 000 bp) 斷裂的凋亡細胞。不能檢測DNA 斷裂末端的準確數量,因為每個末端結合的標記分子的數量可因反應動力學而不同。若樣品處理不當,易形成假陽性,影響結果判斷。 第七十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月793.免疫學方法(

35、ELISA法) 利用“夾心酶標免疫測定法”的原理,核小體DNA由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復合物而不被核酸內切酶裂解，用抗組蛋白（或抗DNA）-過氧化物酶（或生物素化的抗體） 結合到核小體，通過酶標儀分析,可定量反映細胞凋亡水平。第七十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月80核小體酶底物第八十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月81 ELISA方法的優點是:靈敏度高,操作快捷,無放射性同位素污染,可定量測定細胞凋亡,無需預先標記細胞,所用抗體不具有種屬特異性, 酶標記的抗DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的DNA 起反應。 夾心法可以測定核小體單體和寡聚核小體，因而

36、可以用于許多不同的培養細胞株或動物組織細胞的凋亡檢測 。第八十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月824.組織化學方法： 細胞凋亡的相關蛋白分析:如p53 蛋白、c-myc 、Fas 、Bcl-2 家族蛋白等。測定方法主要有流式細胞儀檢測法、蛋白印跡法及免疫組織化學染色法等。第八十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月835.分子生物學方法： PCR 是檢測凋亡特異性基因的常用方法。 PCR 被用來擴增凋亡細胞產生的DNA 片段,當瓊脂糖凝膠電泳呈現的DNA 梯形條帶不明顯時,用PCR 擴增后再電泳可見明顯的梯形圖譜； RT-PCR 被用來檢測Bcl-2和caspase表達；

37、 熒光定量PCR 檢測基因表達水平更快更準確。此外,將PCR 技術和核酸分子雜交技術相結合,能顯著提高檢測的特異性和靈敏度。第八十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月846.流式細胞分析術 (flow cytometry，FCM)第八十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月85 亞“G1”峰檢測法:處于增殖周期中的細胞，根據其所處不同周期時相(G0Gl、S、G2M)，其DNA含量分布在2n4n之間。發生凋亡的細胞由于核內DNA裂解成許多小片段，在酒精固定后用細胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜而丟失，僅剩下大片段DNA，這些失去部分DNA含量的細胞，在DNA染色后，形成

38、一個DNA含量2n(即 G 1期細胞)的分布區，稱為“亞G1峰”。6.流式細胞分析術 (flow cytometry，FCM)第八十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月86第八十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月877.細胞凋亡的其它檢測:PS（磷脂酰絲氨酸）在細胞外膜上的檢測: 磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，在凋亡早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V(Ca2+依賴性磷脂結合蛋白)能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、R-PE）或biotin

39、標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發生。細胞內氧化還原狀態改變的檢測： CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。第八十七張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月88細胞色素C的定位檢測：通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發生。線粒體膜電位變化的檢測：端粒酶檢測：

40、mRNA水平的檢測：蛋白印跡法:檢測細胞凋亡的相關蛋白分析:如caspase 、Fas 家族蛋白等.7.細胞凋亡的其它檢測:第八十八張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月89 細胞凋亡檢測技術存在的問題（1）細胞凋亡的判斷標準:目前,檢測細胞凋亡的許多方法的結果判斷標準不一。 形態學檢查是其他各種檢測方法的基礎,任何方法的檢查結果必須結合形態學檢查來判斷。 梯帶狀圖像并不必然與細胞凋亡相關; TUNEL 法在壞死細胞群中也可出現陽性細胞。第八十九張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月90（2）細胞凋亡檢測結果分析: 在一個檢測體系中檢出了發生凋亡的細胞, 生理性還是病理性，需進行致

41、病因素的相關性分析. 細胞凋亡檢測技術存在的問題第九十張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月91 細胞凋亡檢測技術存在的問題（3）細胞凋亡的定量分析： 定量分析包括2 個方面,一是群體細胞凋亡的定量,二是細胞凋亡程度的定量。 目前,流式細胞儀常用作群體細胞凋亡的定量分析,但在檢測中的漏檢率和錯檢率都很高。TUNEL 法雖可進行群體定量,但工作量大,同時易出現壞死細胞的假陽性。第九十一張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月92展 望第九十二張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月93 現代生命科學的發展動態 細胞生物學與分子生物學(包括分子遺傳學與生物化學) 相互滲透與交融是總的

42、發展趨勢。 （細胞凋亡研究所處的地位）第九十三張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月94生命科學的研究從宏觀上可以分為 三個層次：核心層次（包括分子生物學和細胞生物學學科）個體生物學層次（對多個物種及種群的結構及功能研究）生物圈層次。無論是對細胞結構和功能的深入研究，還是對細胞重大生命活動規律的探索，都需要用分子生物學的新概念與新方法，在分子水平上進行研究，換句話說，細胞分子生物學或分子細胞生物學將是今后相當一段時間的主流。第九十四張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月952007年美國科學院院報（PNAS）的一篇文章中，通過數學方法，對科學雜志的引用關系進行了分析，對當前的88個研究領域進行了排序。 分子與細胞生物學當之無愧成為最大熱門。第九十五張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月96第九十六張，PPT共一百零二頁，創作于2022年6月97對細胞生命活動的研究成為當今生命科學發展的瓶頸細胞生命活動突變體分析突變體分析蛋白修