1、基因工程和基因組學 1學習要點 1 掌握基因工程的概念及主要操作程序2 掌握限制性內酶的基本性質3 掌握載體的基本性質及種類4 掌握重組DNA導入受體細胞的方法5掌握目的基因的分離與鑒定的方法6 了解基因工程的應用7 了解基因組學的研究內容和進展8 掌握基因圖譜和遺傳標記的種類、特點9 了解功能基因組學和蛋白質組學研究的內容及動態 2基因工程和基因組學 1 基因工程 遺傳工程概述 基因工程主要操作程序2 基因組學 基因組學概述 基因組圖譜的構建 基因組測序 功能基因組學3第10章 基因工程 基因工程概述限制性核酸內切酶 載體重組DNA導入受體細胞的方法 目的基因的分離與鑒定 基因工程的應用4一

2、、基因工程概述 （一）基因工程的概念及意義廣義的遺傳工程包括基因工程，胞工程、酶工程、生化工程和蛋白質工程等。狹義的遺傳工程專指基因工程 。基因工程是指以分子生物學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建重組DNA分子，然后導入受體細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品 。5基因工程操作的對象是DNA分子。又稱為重組DNA技術基因工程的發展直接推動著其他學科的發展。6（二）基因工程的主要操作程序獲得目的基因； 重組DNA分子的構建 ；將重組DNA分子引入到受體細胞中；轉化子篩選 ；目的基因的表達和功能鑒定。 7二、限制性內

3、切核酶（一）限制性內切酶概述 限制性內切酶或稱限制性酶(restriction enzyme), 是生物體內能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶 。限制性內切酶是基因工程中最重要的工具酶。8Eco R 9限制性內切酶的命名原則：根據分離出這種酶的細菌在分類學上的屬名、種名和菌株名來命名。名稱的第一個字母是該細菌的屬名的第一個字母，大寫，斜體。名稱的第二、三個字母是該細菌種名的前兩個字母，小寫，斜體。名稱的第四個字母是菌株的名稱，大寫或小寫，正體。如果沒有菌株名稱就不寫。名稱最后的是羅馬數字，表示從這種細菌中分離出來的酶的序號，如從某個菌株中分離出來的第一種酶為，第二種酶為，等等。1

4、0如EcoR來自大腸桿菌（Escherichia coli）R菌株，讀作echo-r-one；Hind 來自流感噬血桿菌 （Hemophilus influenzae）d菌株,讀作hind-three 11限制酶的分類限制性核酸內切酶的工作分為2個步驟： 識別特定的DNA序列 在特定的位置切割DNA分子根據其作用特點,可以將限制性酶分為三種類型： 型 型 型。在基因工程中用途最廣泛的是型限制酶。12型限制酶有特定的識別序列但切割位置遠離識別位置有的種類可以在同識別序列相距1000bp的位置上隨機切割DNA分子在基因工程中沒有什么用途13型限制酶有特定的識別序列切割位置在識別序列3端相距20bp

5、處，可以產生各種類型的單鏈末端。型限制酶在基因工程中有特定的用途，但總體來說，用途不大。14型限制酶在DNA上有特定的識別序列而且其切割位點就在識別序列內部基因工程中用途最廣識別序列是對稱的，在一條鏈中從5到3方向的序列與其互補鏈從5到3方向的序列完全相同，稱為回紋對稱序列(palindrome)。 15常見內切酶16（二）限制性內切酶產生的末端1限制性內切酶產生的粘性末端 粘性末端（cohesive end）是指DNA分子在限制性內切酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。 172. 限制性內切酶產生的平末端 平末端是指在識別序列對稱處同

6、時切開DNA分子兩條鏈，產生的平齊末端結構，平末端則不易于重新環化。 183. 限制性內酶產生非對稱突出端 許多限制性內切酶切割 DNA 產生非對稱突出端。當識別序列為非對稱序列時，切割的 DNA 產物的末端是不同的。 19（三）同裂酶和同尾酶 1.同裂酶：不同種類的限制性內切酶往往具有不同的識別位點，但也有些來源不同的限制性內切酶能識別和切割相同的核苷酸序列，這類內切酶稱為同裂酶 。 202. 同尾酶：識別的DNA序列不同，但能產生相同粘性末端的限制性內切酶稱為同尾酶。21（四）酶切和連接 利用限制性核酸內切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過程中的關鍵步驟之一。 成功的酶

7、切和有效的連接為后續的外源基因進入宿主細胞進行表達提供了有效的實驗材料。22 常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶，其作用底物是雙鏈的DNA分子或RNA：DNA雜交分子，可以連接粘性末端、平末端。23酶切與連接24三、載體(vector) （一）載體的概述 載體是基因工程中能將目的基因轉移到受體細胞中的一種能自我復制的DNA分子 。通過載體可以把目的基因導入受體細胞中。25載體的基本條件 在宿主細胞中能保存下來并能大量復制。 具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA 片段。 含有復制起始位點，能夠獨立復制。 有一定的標記基因，便于進行篩選。26載體的分類 根據DNA克隆目的不同，可以把載體

8、分為克隆載體、表達載體和穿梭載體等不同類型。 27（二）克隆載體 常見的克隆載體包括有質粒、噬菌體和病毒載體 、粘粒、酵母人工染色體、細菌人工染色體 、P1噬菌體載體和PAC載體等。 28pBR322質粒 質粒pBR322是第一個人工構建的重要基因工程載體，經過人工改造后，具體基因工程載體的基本特征。29pBR322質粒物理圖譜 30 2. pUC質粒 pUC質粒是另一類基因工程載體，最常見的有pUC18質粒，是在pBR322基礎上構建的另一種載體。 31pUC18質粒物理圖譜323. Ti質粒 主要用于植物基因工程操作，Ti質粒是在根瘤土壤桿菌細胞中存在的一種染色體外自主復制的環形雙鏈DNA

9、分子，大小約為200 kb。 Ti質粒既有在細菌中表達的基因，又有在高等植物中表達的基因，經改造后可作為植物基因工程的載體。33Ti質粒結構T-DNA （Transfer DNA）是農桿菌侵入植物細胞時從Ti質粒上轉移到植物細胞的一段DNAT-DNA兩端個有一段25bp的同向重復序列，是T-DNA的邊緣區LB；RB在同一條單鏈的LB和RB內各形成一個缺口，單鏈T-DNA進入植物細胞。34含有T-DNA的pABT27質粒 354. 噬菌體和病毒載體 噬菌體（phage）是感染細菌的一類病毒，如噬菌體和T噬菌體等。 病毒載體：感染動物的病毒經改造后可用作動物細胞轉化的載體 。常見的有猿猴空泡病毒4

10、0（SV40）、逆轉錄病毒和昆蟲桿狀病毒等。 36噬菌體（30kb） 375.粘粒 帶有噬菌體黏性末端cos的質粒稱為粘粒。插入粘粒載體的外源DNA片段的長度可大于40 kb，從而大大增加了載體攜帶外源DNA的能力。 38 粘粒pJB8物理圖譜 396. 酵母人工染色體 酵母人工染色體（yeast artificial chromosomes，YAC）是人工染色體中能克隆最大DNA片段的載體，可以插入100-2000 kb的外源DNA片段。 407. 細菌人工染色體 細菌人工染色體（bacterial artificial chromosomes，BAC）是以細菌F因子為基礎構建的細菌克隆載體

11、。廣泛用于基因文庫的構建 。41細菌人工染色體BAC（300kb）428. P1噬菌體載體和PAC載體 P1噬菌體載體與噬菌體載體相似也缺少野生型噬菌體基因組的一個片段 ，但P1基因組比基因組更大，克隆的DNA片段可以達到125 kb 。 PAC載體是 P1噬菌體載體和BAC載體綜合一起產生的載體，具有P1噬菌體載體和BAC載體的優點，容納的DNA片段可達300 kb。 43 PAC載體pCYPAC2圖譜44（三）穿梭載體和表達載體1. 穿梭載體（shuttle vectors）是指同時可在兩種不同生物中穩定存在的載體。 穿梭載體含有兩種生物不同的復制子序列，在其中一種生物中，與該生物有關的復

12、制子有活性，另一復制子關閉。 452. 表達載體（expression vectors） 是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件：如啟動子、調節基因、核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）、終止子等，使目的基因能夠表達的載體 。46四、 重組DNA導入受體細胞的方法（一）重組DNA導入細菌細胞 原核生物的遺傳轉化可以通過CaCl2處理轉化、電激轉化等方法。 47（二）重組DNA導入植物細胞 重組DNA導入植物細胞的方法有農桿菌介導法、基因槍轉化法、花粉管導入法等，其中以農桿菌介導法和基因槍轉化法最為常用。48根癌農桿菌轉化技術根癌農桿菌（Agrobacteriu

13、m tumefaciens)根癌農桿菌介導的植物轉化是應用得最早而廣泛的一種植物轉化方法。雙子葉植物、單子葉植物都可以用。49將目的基因與花椰菜花葉病毒35S啟動子及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質粒的RB與LB之間構成重組質粒轉化根瘤土壤桿菌細胞重組根瘤土壤桿菌感染植物細胞使質粒的部分DNA與目的基因一起整合到植物染色體上，實現遺傳轉化 50植物轉基因過程51基因槍法基因槍（gene gun）法，又稱微粒轟擊法（microprojectile bombartment，biolistics）依賴高速的金屬微粒將外源基因導入植物細胞優點：無宿主限制，可用于任何基因型的材料缺點：轉化頻率低

14、，結果重復性差，多拷貝導入導致基因沉默，實驗成本高52（三）重組DNA導入動物細胞1. 顯微注射法2. 體細胞移植技術 53五、目的基因的分離與鑒定根據已知的基因序列，或根據氨基酸序列推測DNA序列。將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結合起來，可以很快地人工合成基因。（一）化學合成基因54（二）目的基因克隆的策略1. 根據已知堿基序列或氨基酸序列克隆基因 2. 根據表型變異克隆基因3. 圖位克隆法分離目的基因 4. 電子克隆技術分離目的基因55（三）基因文庫的構建與目的基因的克隆1. 基因文庫 基因文庫（gene library）是指用重組DNA技術將某種生物細胞的總DNA 、染色

15、體DNA所有片斷隨機地連接到基因載體上，然后轉移到適當的宿主細胞中，通過細胞增殖而構成各個片段的無性繁殖系（克隆），在制備的克隆數目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。 56基因文庫包括:基因組文庫（genomic Library）染色體文庫（chromosome Library）cDNA文庫（cDNA Library）等。57 基因組文庫 是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段，并與合適的載體重組后導入宿主細胞進行克隆，這些存在于所有重組體內的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫。 58基因組文庫的構建（1）DNA的純

16、化： 構建基因組文庫的基因組DNA必須進行純化后，才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機片斷。（2）DNA的酶切： 用限制性內切酶對已經純化的DNA進行切割，以產生小片段的DNA，便于連接到適宜的載體中。59（3）連接： 將酶切的DNA片段連接到合適的載體中，形成重組子。構建基因組文庫可采用不同的載體，包括質粒載體、噬菌體載體、BAC（細菌人工染色體）或YAC（酵母人工染色體）等。（4）轉化： 重組子轉化合適的宿主菌，建立基因組文庫。60基因組文庫的構建 61染色體文庫是指將基因組的一部分如某條染色體全部DNA來構建基因文庫，可以用來選擇特異基因及對染色體的結構進行分析。62cDNA文庫是指

17、以mRNA為模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。 632. 從基因文庫分離特定的基因（1）制備DNA探針 （2）篩選文庫 （3）序列測定和功能分析 64DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸 單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記65篩選文庫質粒基因庫篩選細菌混合液在培養在平板上轉移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌

18、落、培養抽提質粒 66（四）目的基因克隆的鑒定與分析1. 遺傳學選擇和篩選方法（1）抗藥性標記插入失活選擇法 pBR322質粒編碼有Tetr和Ampr，只要將轉化的細胞培養在含有四環素或氨芐青霉素的生長培養基中，便可以容易地檢測出獲得此種質粒的轉化子細胞。6768（2）-半乳糖苷酶顯色反應選擇法 根據插入失活原理，將外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成-半乳糖苷酶失活效應，可以通過大腸桿菌轉化子菌落在Xgal-IPTG培養基中的顏色變化直接觀察出來。 69插入失活的原理702. 分子雜交檢測（1）Southern雜交 它是一種DNA-DNA雜交，其基本原理是：利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性

19、內切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜，經過干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的標記探針行雜交，用放射自顯影反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。 71轉基因水稻拷貝數的Southern檢測 72（2）Northern 雜交 它是一種DNA-RNA雜交，主要用于檢測轉基因生物外源基因轉錄表達。如果外源基因整合到染色體后，能夠正常表達，受體生物細胞將有其轉錄的產物mRNA的生成。 73（3）Western雜交 Western雜交（Western blot）主要用于檢測外源基因是否表達出蛋白質。 743. 目的基因序列分析和功能分析在獲得目的基因后，

20、需要對目的基因作進一步的分析，最準確的分析方法是序列分析。 75核酸序列測定的原理76測序電泳圖譜77核酸序列分析與功能預測 同源性比較 同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。 從核酸及蛋白質兩種水平比較基因間的同源性。 將測出的核酸序列同雜交的探針序列進行比較 將得到的序列發到BLAST等DNA Data庫的網址上比較78開放閱讀框（open reading frame, ORF）分析開放閱讀框：一段能編碼一條多肽鏈，并具有翻譯起始信號（ATG）和終止信號 (TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。來自cDNA庫的序列可直接進行0RF分析，比較其與其他序列的同源性來確定其身份。來自核基因庫

21、的序列，因大多數真核生物基因含有內含子。79開放閱讀框（open reading frame, ORF）分析80 TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG 61 CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC121 TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181 CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGC

22、ATGTCATGA241 TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301 CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361 CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421 TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481 AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGT

23、TATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541 TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601 GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661 AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721 TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781 AGTAGTACAAA

24、AATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841 GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901 CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC961 GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021 AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAG

25、AAGGAA1081 GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141 GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201 GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261 TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321 TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATA

26、CATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381 ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441 ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501 GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561 ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621 TACA

27、TCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681 TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741 TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801 CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861 ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGT

28、TTGCTGATCGTCGATT1921 ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981 TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041 TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101 TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161 TTGGAGTCTTCTCCCGCGC

29、TACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221 CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT2341 GTGCTTGTGCT 2351bp81（五）PCR技術與基因克隆 1 PCR技術的概述 （1）基本原理是：根據堿基互補配對原則，在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應合成靶序列。 82PCR聚合酶鏈式反應(p

30、olymerase chain reaction)83（2）基本步驟： 變性 94-95,雙鏈變性成單鏈 復性 50-70,兩個引物分別與單鏈DNA互補 延伸 72,在引物Taq酶的作用下從53的方向合成模板DNA的互補鏈。 84（3）PCR 技術的關鍵人工合成寡核苷酸片段（引物）耐熱的Taq DNA polymerase852. PCR技術在基因克隆中的應用 (1)目的基因的克隆； (2)文庫構建和篩選； (3)cDNA文庫的構建; (4)重組子和轉化子的篩選、鑒定。86首先化學合成多個含有80100個核苷酸的寡聚核苷酸每個寡聚核苷酸片段之間有1924個核苷酸的重疊序列再將各個寡聚核苷酸等量

31、(摩爾濃度)混合，在DNA聚合酶 (或Taq酶)作用下，各寡聚核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補齊成為雙鏈。再用兩個PCR引物，經PCR擴增出DNA片段。若將兩個DNA片段放在一起，經SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)擴增出完整的基因片段87基因工程的應用1、基因工程與醫藥工業2、植物基因工程的應用3、動物基因工程的應用 4、基因治療和基因診斷5、基因工程技術在環境保護中的應用 6、轉基因產品的安全性評價 88基因工程與醫藥工業生產重組藥物、主要是生產高產值、高效率的基因藥物 。89人工生產胰島素90植物基因工程的應用 抗蟲植物 抗除草劑植

32、物 1996年開始轉基因作物投入生產 2003年，抗蟲作物 1000萬hm2 抗除草劑作物 5000萬hm2 美國轉基因棉花 80；全球 50 我國進口的大豆絕大部分是轉基因大豆91動物基因工程的應用 比轉基因植物發展慢 原因：涉及社會倫理和宗教問題 在技術上動物細胞的再生能力 克隆羊Dolly 轉基因魚是比較成功的 將重組DNA導入受體合子細胞核中，借助于母體環境實現轉基因動物生產92基因治療和基因診斷正常基因替代缺陷基因修復突變基因制造疾病診斷試劑盒生產疫苗 用酵母菌生產人乙肝疫苗是第一個真核生物基因工程的商業化產品有人設想將蜘蛛絲彈性蛋白基因轉入植物，生產彈性蛛絲蛋白，治療人類軟骨細胞增

33、生。93基因工程用于環境保護利用轉基因微生物降解污染物如：油船事故的處理94轉基因生物的安全性評價 對環境的安全性 對人類健康的安全性 宗教及倫理問題 風險未知 既不能夸大風險，也不能掉以輕心 國家有完善的安全性評價程序和一系列的政策法規95第11章 基因組學基因組學概念基因圖譜的構建功能基因組學蛋白質組學 96一、基因組學的概念基因組（genome），是指一個物種單倍體的染色體數目及其攜帶的全部基因 。生物基因組是物種遺傳信息的“總詞典”是控制發育的“總程序”也是生物進化歷史的“總檔案”97 一個物種單倍體基因組的DNA含量是相對恒定的，通常稱為DNA的C值（C value）。一般說來，隨著

34、生物的結構和復雜程度的增加，需要的基因數和基因產物種類越多，C值就越大。 98 但生物的C值大小并不能完全反映生物進化程度和遺傳復雜性的高低，也就是說物種的C值與它的進化復雜度之間并沒有十分嚴格的對應關系，這種現象稱為C值悖理 。99基因組學（genomics） 基因組學指對所有基因進行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜和轉錄圖譜等）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學 。 1986年提出，至今二十多年，已經發展成為遺傳學中最重要的分支學科。100基因組學研究的最終目標獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關系闡明基因組的進化規律101幾個代表物種的基因

35、組大小102基因組學的研究內容 結構基因組學 功能基因組學 蛋白質組學103結構基因組學（structural genomics） 基因定位 基因組作圖 測定核苷酸序列104功能基因組學（functional genomics） 又稱后基因組學（postgenomics) 基因的識別、鑒定、克隆 基因結構、功能及其相互關系 基因表達調控的研究105蛋白質組學（proteomics）鑒定蛋白質的產生過程、結構、功能和相互作用方式。106人類基因組計劃1990年10月，人類基因組計劃啟動。1998年5月，美國塞萊拉遺傳公司宣布獨立進行人類基因組測序，并計劃2001年完成人類基因組全序列測定，與國際

36、人類基因組計劃開展競爭。1999年11月，中國加入國際人類基因組計劃，承擔1%的測序任務。 2000年月，科學家宣布完成人類基因組的“工作草案” 。2001年2月，公布人類基因組圖譜的修訂版。2003年月，科學家宣布人類基因組測序工作結束 。107二、基因組圖譜的構建基因組計劃的主要任務是獲得全基因組序列但是，現在的測序方法每次只能測8001000bp大量的測序片段要拼接要知道序列在染色體上的位置才能正確拼接基因組計劃的第一個環節： 構建基因組圖譜108基因組圖譜遺傳圖譜物理圖譜轉錄圖譜測序圖譜109（一）遺傳圖譜的構建 采用遺傳分析的方法將基因或其它DNA序列標定在染色體上構建連鎖圖。110

37、1.遺傳標記有可以識別的標記，才能確定目標的方位及彼此之間的相對位置。構建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標記。包括： 形態標記 細胞學標記 生化標記 DNA分子標記111(1)形態標記形態性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標記數量少很多突變是致死的受環境、生育期等因素的影響112 遺傳學中最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態性狀作為標記，分析它們連鎖關系及遺傳距離，繪制而成的。 控制性狀的其實是基因，所以形態標記實質上就是基因標記。113果蠅連鎖圖114(2)細胞學標記明確顯示遺傳多態性的染色體結構特征和數量特征 染色體的核型 染色體的帶

38、型 染色體的結構變異 染色體的數目變異優點：不受環境影響缺點：數量少、費力、費時、對生物體的生長發育不利115(3)生化標記 又稱蛋白質標記 就是利用蛋白質的多態性作為遺傳標記。 如：同工酶、貯藏蛋白 優點：數量較多，受環境影響小 缺點：受發育時間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區的信息116(4) DNA分子標記簡稱分子標記以DNA序列的多態性作為遺傳標記優點： 不受時間和環境的限制 遍布整個基因組，數量無限 不影響性狀表達 自然存在的變異豐富，多態性好 共顯性，能鑒別純合體和雜合體117限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphis

39、m，RFLP）DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當于一對等位基因的差異。 如有兩個DNA分子（一對染色體），一個具有某一種酶的酶切位點，而另一個沒有這個位點，酶切后形成的DNA片段長度就有差異，即多態性。可將RFLP作為標記，定位在基因組中某一位置上。人類基因組中有105個RFLP位點，每一位點只有兩個等位基因。118RFLP分析119RFLP標記位共顯性標記120微衛星（microsatellite）標記微衛星又稱為簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）。這種重復序列的重復單位很短，常常只有2個、3個或4個核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC 另一染色

40、體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構成了多態性。1212.遺傳圖譜的原理 理論基礎: 連鎖與交換 基本方法: 兩點測驗法和三點測驗法122水稻遺傳圖 1994年，水稻第一張高密度遺傳圖譜 927個位點， 1383個標記 1998年，1157個位點，2275個標記2000年，3267個標記高密度的遺傳圖譜為基因組測序和遺傳研究奠定了堅實的基礎。1233.人類遺傳圖譜的構建 不可能根據需要選擇親本，設計雜交組合，構建分離群體！ 只能檢測現存家庭連續幾代成員的基因型 家系分析法 資料有限、必須借助于統計學方法124現有的人類遺傳圖譜 122號染色體 8個家系134個成員 X染色體，12個家系170個成員 5364個SSR標記 2335個位點 標記間的平均距離599kb125(二) 物理圖譜的構建 物理圖譜是將基因組以 DNA 片段或核苷酸序列排列而成的圖譜，反映了染色體上基因或標記間的實際距離。 126物理圖譜的類別1、限制性酶切圖譜2、重疊群圖譜 3、DNA 序列圖譜