1、KRAS和EGFR檢測與臨床應用第1頁，共41頁。匯報內容KRAS和EGFR的簡介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術特點等位特異性引物設計KRAS試劑盒開發簡介第2頁，共41頁。KRAS和EGFR的簡介及臨床意義第3頁，共41頁。KRAS背景KRAS是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號通路的調控；EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結合后可以激發其酪氨酸激酶活性，導致KRAS的活化和通路中信號傳導；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結直腸癌（

2、40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。第4頁，共41頁。KRAS基因突變影響結直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉移性結直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med第5頁，共41頁。結直腸癌患者檢測KRAS突變相關指南歐洲藥品評估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進展期結直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學會（ASCO，2009）推薦：轉移性結直腸癌患者應檢測KR

3、AS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應進行EGFR單克隆抗體治療；美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉移性結腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準第一個用于結直腸癌的基因檢測（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網絡（NCCN，2014）指南說：轉移性結直腸癌患者均應進行RAS突變檢測（KRAS和NRAS），至少應檢測KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛生部于2010年10月14日發表了結直腸癌診療規范（2010版） 。明確指出在患者確定為復發或轉移性結

4、直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態。在晚期/轉移性結直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤 K-ras 基因狀態，EGFR不推薦作為常規檢查項目。第6頁，共41頁。KRAS基因突變影響非小細胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發生抵抗； KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Cli

5、n Oncol 第7頁，共41頁。非小細胞肺癌患者檢測KRAS突變相關指南美國國立綜合癌癥網絡（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細胞肺癌患者TKI抵抗有關，KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當KRAS基因發生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進行分子靶向治療。第8頁，共41頁。KRAS主要突變位點在結直腸癌中，KRAS突變主要發生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E7

6、46-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)

7、12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C

8、(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213第14頁，共41頁。EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關系所在外顯子突變類型與EGFR-TKI療效關系18G719A(S/C)3種點突變藥敏突變1919種缺失突變藥敏突變20點突變S768I藥

9、敏突變20點突變T790M耐藥突變*203種插入突變耐藥突變*21點突變L858R藥敏突變21點突變L861Q藥敏突變第15頁，共41頁。ADx EGFR試劑盒突變結果檢測組別突變類型所占比例對吉非替尼敏感性證據 1Exon 19 deletions; L858R 90%充分2T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3%無第16頁，共41頁。ARMS-PCR的基本原理和技術特點第17頁，共41頁。ARMS-PCR原理ARMS是Am

10、plification Refractory Mutation System (擴增阻礙突變系統)的縮寫。根據 PCR過程中要求引物和模板間的嚴格互補配對來實現對突變位點的檢測, 當引物 3 末端出現錯配時, 產物將不能延伸。因此設計兩條上游（或下游）引物，使其3末端分別與突變位點堿基匹配和錯配，共用下游（或上游）引物，分別擴增野生型和突變型目的片斷。第18頁，共41頁。ARMS-PCR原理Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one

11、 of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics第19頁，共41頁。PCR產物檢測-Real

12、time PCR每個PCR循環檢測熒光信號，不同PCR產物，不同熒光信號相比凝膠電泳：更快，可定量，無PCR產物污染信號產生方法：Scorpion (Qiagen)，雙環探針(廈門艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer第20頁，共41頁。應用于Real time-PCR的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA all

13、ele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe第21頁，共41頁。ARMS技術特點優點：靈敏度高（0.1-1%）操作簡便周期短不產生PCR產物污染適用樣本類型多（如FFPE）精確突變類型缺點：方法建立需時較長僅能檢測已知突變第22頁，共41頁。測序法與ARMS法相比較Sanger測序法焦磷酸測序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標本成功率 低較高高商用試劑盒無有有流程與速度1-2天2-3天AGTGly13SerGGCA

14、GCGly12ArgGGTCGTGly13ArgGGCCGCGly12CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC第29頁，共41頁。三引物設計原理You F. M. 2008, BMC Bioinformatics第30頁，共41頁。三引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGA

15、ATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，54第31頁，共41頁。三引物設計下游引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACA

16、GCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列：5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3互補鏈：3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5下游引物：5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3第32頁，共41頁。3端增加錯配如果3端是弱錯配（C/A或G/T）則需要引入強的錯配（A/G或C/T）才可阻斷3端的擴增；如果3端是強錯配（A/G或C

17、/T）則需要引入弱的錯配（C/A或G/T）或不需引入錯配即可阻斷3端的擴增；當3端是中度錯配（A/A，C/C，G/G 或T/T）則需要引入中度的錯配。野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3第33頁，共41頁。四引物設計第34頁，共41頁。四引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATAT

18、GATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 內引物（R）5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3外引物（F）5-ATGACTGAATATAAACT-3外引物（R）5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3第35頁，共41頁。KRAS試劑盒開發簡介第36頁，共41頁。KRAS突變探針和引物設計KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGC

19、AAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4. 5- ATAAA CTT GTG

20、GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8. 參照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-39. 下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探針：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3鎖核酸阻滯探針(野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3浙