1、肝衰竭機制和治療研究進展內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室 肝衰竭患者病情危重極度乏力，消化道癥狀，腹脹或腹水；黃疸進行性加深（TB171umol/L或每天上升17umol/L）；明顯出血傾向，PTa40%；肝性腦病和/或肝臟進行性縮小。 肝細胞大片壞死 各種類型肝衰竭發病機制、關鍵物質尚未明確內科綜合治療：病死率達80 如何提高療效是國際性難題內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室肝衰竭的定義肝衰竭是由多種因素引起肝細胞嚴重損害，導致其合成、解毒和生物轉化等功能發生嚴重障礙，出現以黃疸、凝血功能障礙、肝性腦病和腹水等為主要表現的一種臨床綜合征 中華醫學會感

2、染病分會、肝病分會肝功能衰竭與人工肝學組. 肝功能衰竭診療指南. 中華傳染病雜志.2006，24：422我國肝衰竭診療指南已頒布內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室肝衰竭的分類急性肝衰竭急性起病，2周以內出現肝衰竭的臨床表現亞急性肝衰竭起病較急，15日24周出現肝衰竭的臨床表現慢加急性肝衰竭在慢性肝病基礎上出現急性、亞急性肝衰竭臨床表現慢性肝衰竭在慢性肝病基礎上,出現肝功能進行性減退或失代償中華醫學會感染病分會、肝病分會肝功能衰竭與人工肝學組. 肝功能衰竭診療指南. 中華傳染病雜志.2006，24：422內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室常 見少見或罕見肝

3、炎病毒代謝異常 - 甲, 乙, 丙, 丁, 戊 - 肝豆狀核變性, 糖代謝缺陷非肝炎病毒缺血, 缺氧 - CMV, EB, 腸道病毒 - 休克, 充血性心衰藥物及毒物自身免疫性肝損害 - 異煙肼, 利福平, 醋氨酚等 - 酒精, 四氯化碳, 毒蕈等肝移植, 部分肝切除, 肝臟腫瘤先天性膽道閉鎖細菌及寄生蟲其他 - 嚴重細菌感染, 血吸蟲等創傷, 熱射病, 妊娠急性脂肪肝肝衰竭的病因中國病毒性肝炎為主歐美藥物 、酒精性為主內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室肝衰竭的病理生理肝細胞大量壞死肝功能衰竭代謝紊亂毒物積聚影響肝細胞再生惡性循環免疫紊亂腦水腫腎功能不全血流動力學紊亂凝血系

4、統障礙等病毒或毒物發病機制、關鍵物質未明阻斷惡性循環的治療措施有待改善內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室肝 衰 竭 發 病 機 制 目前認為肝損傷導致肝衰竭發生的原因大致可以分為化學性損傷和免疫損傷兩大類化學性損傷與在肝臟解毒的物質有毒性代謝產物相關，通過影響細胞膜、線粒體、胞內離子的穩定和各種降解酶類起作用。免疫性損傷和宿主自身免疫狀態及其易感性、細胞毒性T細胞反應、巨噬細胞的激活、細胞因子、一氧化氮、補體等相關。近年在應用代謝組學方法研究肝衰竭發病過程中未知關鍵物質及以內毒素為軸線的腸道微生態失衡和肝衰竭相關性等方面取得了諸多進展內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治

5、國家重點實驗室腸道微生態在肝衰竭 發生發展中的作用肝衰竭發病機制研究進展內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室微生態是人體的有機組成部分 人體正常菌群種類500余種 數量100萬億個（人體體細胞僅10萬億個） 平均重約1.5kg，相當于肝臟的重量 99.9%是以雙歧桿菌和類桿菌為主的專性厭氧菌 0.1%是以腸桿菌科細菌為主的兼性厭氧菌1g1000g(80%)20g200g20g10g20g內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室森林砍伐等 宏觀生態破壞 洪水、沙漠化、沙塵暴等宏觀生態破壞政府已高度重視微觀生態破壞21世紀全球面臨的新問題 亟需新理論、新方法抗生素免

6、疫抑制劑肝病等疾病微生態失衡嚴重危害人體健康Steven R. Gill et al. Science, 2006 312破壞微生態就是損害人類健康Gordon, Washington University微生態失衡細菌耐藥難治性感染肝衰竭等多器官功能不全內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室Science, June 2005,308: 1635-1638國際學界對腸道微生態的再認識腸道微生物是人體提供營養，調控上皮發育和指導先天性免疫的不可缺少的“器官”Paul Eckburg, Stanford UniversitySteven Gill, Karen Nelson, T

7、IGR/VI內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室微生態學研究技術平臺的發展Yu y, Sheng GP,et al J Proteom Res, 2007;6:2413-19類桿菌雙歧桿菌Real Time PCRPCR DGGE細胞水平：建立并優化腸道厭氧菌培養與菌種保存體系分子水平：應用PCRDGGE， Real-Time PCR 技術研究腸道微生態細菌個體及群體的變化代謝組學：分析腸道菌群多樣性與人體代謝的相關性內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室感染微生態與肝病相關系列研究動物模型研究（大鼠）急性肝衰竭模型（30只）肝臟缺血再灌注模型（36只）肝移植

8、模型（80只） 臨床研究慢性肝炎（30例）慢性重型肝炎患者（31例）肝硬化患者（51例）肝移植患者（113例）大鼠肝移植慢重肝肝硬化肝移植大鼠肝缺血再灌注采 樣 ： 血、糞便、肝組織、腸道組織、腸系膜淋巴結等檢測內容： 生化、內毒素、細胞因子、細菌培養、分子生態、組織病理及代謝組學內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室研究發現慢性肝衰竭患者腸道菌群嚴重失衡P0.001P0.05雙歧桿菌類桿菌P0.001P0.01P0.01P0.05酵母菌P0.05腸球菌P0.001P0.05腸桿菌科細菌 雙歧桿菌 類桿菌 腸桿菌科細菌 腸球菌 酵母菌Li Lj，et al, Chin Med

9、J . 2001:114(12):869-872 內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室研究發現肝病腸道微生態失衡與內毒素血癥 密切有關腸粘膜屏障損傷微生態失衡腸道定植抗力肝I/R大鼠血內毒素水平重肝及慢肝病人血內毒素肝衰竭大鼠血內毒素內毒素血癥Li Lj，et al, Chin Med J . 2001:114(12):869-872；Li LJ et al, WJG 2004; 10(14) :2087-2090 肝細胞壞死內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室BIF/Lact組I/R 組重肝病人內毒素下降比較微生態調節改善肝功能六組肝功能指標比較ALTI/

10、R 組BIF/Lact組肝組織損傷腸粘膜損傷內毒素肝功能Chen CL,et al. J Infect 2007;54:98-102 Li Lj，et al, Chin Med J . 2001:114(12):869-872 Li Lj et al.World J Gastroenterol. 2004,15:2087-90. 應用微生態調節劑，可通過有效調節腸道微生態，降低肝病內毒素血癥，有效改善肝臟功能內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室腸道微生態變化與肝衰竭模式圖低蛋白血癥腸壁淤血水腫腸蠕動膽汁分泌雙歧桿菌等、腸桿菌科細菌等腸道定植抗力腫瘤壞死因子白介素1等肝細胞壞死

11、微生態療法內毒素血癥腸道細菌移位內毒素 、移位微生態失衡肝衰竭自發性腹膜炎菌（敗）血癥內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室肝衰竭代謝組學研究以尋找 肝衰竭發生發展關鍵物質肝衰竭發病機制研究進展內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室繼基因組學、蛋白質組學后，近年興起的生命學科主要研究由機體病理生理刺激或遺傳變異引起的多參數代謝應答，以及代謝物變化規律代謝組學代謝組學、基因組學、蛋白質組與環境之間存在相互作用、相互依存的關系內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室闡明肝衰竭發生發展關鍵物質meanvar. 1var. 2var. 3主成分分析（PCA

12、）降維處理代謝譜分析對分組準確性樣品采集、前處理質譜檢測代謝物獲得大量代謝物數據起關鍵作用的代謝標志物分析肝衰竭代謝組學研究方法內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室建立了GC-MS研究代謝組學的方法 J proteome res. 2007, In press重型肝炎（肝衰竭）代謝組學研究 對血清樣品應用新的衍生化方案進行代謝組學研究，氣相色譜質譜（GC-MS）總離子流譜圖具有良好的重復性內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室代謝譜主成分分析判斷肝衰竭患者病情健康對照組肝衰竭組健康對照組 肝衰竭組 病例選擇：肝衰竭24例健康對照23例健康對照組和肝衰竭組經主成

13、分分析，可完全區分開內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室代謝譜與MELD分級進行判別分析，發現代謝譜可判斷肝衰竭嚴重程度，其預測正確率達91.7%* MELD 30 20 MELD 30 MELD 20疾病嚴重程度代謝譜與MELD分級比較重型肝炎肝衰竭血清代謝組學研究為病毒性肝炎嚴重程度判斷標準的完善提供了新的思路內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室慢加急肝衰竭代謝組學研究研究對象：慢加急肝衰竭37例健康對照50例實驗方法：LC-MS研究目的：檢測新的判斷疾病的標志物，為臨床診斷和治療提供依據差異代謝物UPLC-Q-TOF檢測兩組不同來源分組代謝譜的差異內科

14、學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室（）健康人（）肝衰竭患者各項GC-MS檢測代謝物譜圖：谷胺酰胺、苯丙氨酸等顯著升高，乳糖、葡萄糖及三羧酸循環相關代謝物濃度下降，核苷血清水平升高，這些與肝臟損傷直接相關健康組肝衰竭組苯丙氨酸 谷胺酰胺 乙二酸纈氨酸 甘氨酸 葡萄糖 3-羥基-1,2,3-丙烷三羧酸 1-丙烯-1,2,3-三羧酸 尿素 乳酸 蘇氨酸 甘氨酸 L-脯氨酸 L-蘇氨酸 半乳糖絲氨酸甘油酸脯氨酸 L-絲氨酸 脯氨酸 核糖 核糖醇 2-脫氧-吡喃型半乳糖 果糖 葡萄糖 松二糖 半乳糖 軟脂酸 肌醇 * p0.05, * p200萬道爾頓的形式存在，利用小孔徑血漿分離器的應

15、用減少了肝細胞生長因子的減少小孔徑血漿分離器在應用中的另一個優點是：跨膜壓非常平穩*Li LJ, et al. Ther Apher 2005, 9(5):424-429內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室進展血漿透析濾過Plasma Dia-filtration (PDF)將血漿置換與血液透析、血液濾過等結合起來聯合應用 清除向血管內移動較慢的物質可設定脫水量，控制體內水分量血漿使用量減少，僅為PE使用量的一半（1600ml）透析液血漿白蛋白補充液內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室非生物型ALSS方案組合血漿膽紅素吸附血漿置換高膽紅素血癥血漿灌流血漿置換

16、緩慢持續血液透析濾過肝昏迷緩慢持續血液透析濾過血漿置換肝腎綜合征電解質紊亂血漿置換+血液濾過內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室ALSS治療取得顯著療效*Li Lanjuan,et al. Chinese Medical Journal, 2001, 114(9):941-945肝功能明顯改善 P0.001內毒素顯著下降 P0.005蛋氨酸顯著下降 P0.001 BCAA/AAA比值上升P1個月 )和死亡組172 例患者 (存活時間1個月 )方法: 比較兩組患者人工肝治療后72120 h和24 h實驗室資料和臨床并發癥改善程度：結果:實驗室資料和臨床并發癥：24 h : 兩組

17、均明顯改善(p0.05) 改善程度：無論24h還是72120h, 兩組均改善，但死亡組均明顯小于存活組 (p0.05), 特別是72120 h. 根據24h、72120h改善程度構建兩個logistic 回歸模型預測1個月存活率: 72120 h明顯優于 24 h (92.4% vs 66.4%).結論:The curative effect of ALSS on 1-month mortality in AoCLF patients after 72 to 120 hours Int J Artif Organs 2007; 30: 10人工肝療效早期評估Biochemical parame

18、ters Improvement post-ALSS at 24 h post-ALSS at 72120 h Survival group Control group Survival group Control groupINR -0.85 4.36 -1.47 2.82 -0.68 1.78 * 0.03 2.67Albumin (g/L) 1.24 6.11 1.34 21.99 2.28 3.28 0.86 15.92Globulin (g/L) -5.11 9.71 -4.35 16.00 -3.86 16.70 -2.04 16.41ALT(U/L) -218.07 803.01

19、 -126.9 334.88 -194.14 802.66 -70.57 365.34AST(U/L) -113.90 188.68 -80.82 434.31 -71.99 375.67 -30.61 169.80CHE (U/L) 2290.26 3227.12 2556.35 3120.39 1996.97 2991.36 1048.98 4699.76Tbil (mol/L) -95.65 117.68 -84.32 133.84 -81.78 233.33 -38.48 140.89TB (mol/L) -331.04 208.93* -252.86 222.30 -277.34 2

20、34.17* 23.39 264.56Cre (mol/L) -40.57 7.33* -23.99 13.89 -31.86 46.89* -6.99 13.96Urea (mmol/L) -1.28 1.82 -1.90 9.23 -1.18 4.85 -0.64 1.79(MELD) score -2.32 3.60 -2.27 4.08 -2.21 1.20* 1.02 1.67AoCLF 患者預后取決于人工肝后72120 h肝性腦病、TB、INR、CRE 改善程度內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室人工肝治療后獲得新生的病人內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國

21、家重點實驗室 2000年以來 2002年，中華醫學會感染病分會肝衰竭與人工肝學組成立 推出人工肝治療指南，進一步規范了我國非生物型人工肝的臨床治療2002年人工肝學組第一次會議2006年，感染病分會與肝臟病分會聯合推出肝衰竭診療指南，對肝衰竭的臨床診療具有重大指導意義人工肝治療的標準化和規范化內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室全國非生物型人工肝開展情況（1）截至2005年，我國大陸所有省市均已開展非生物型人工肝治療治療例數：從2000年起至今共治療例數20662例 治療效果：重肝治愈好轉率高至60%以上 全國人工肝開展單位數情況內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重

22、點實驗室全國非生物型人工肝開展情況（2）治療方法ALSS：14932例 血漿置換：4373例血液濾過：290例活性炭/樹脂吸附：71例膽紅素吸附：426例MARS ：450例混合人工肝：120例 我國人工肝治療重型肝炎例數構成內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室生物型人工肝研究進展內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室解毒合成代謝分泌生物型人工肝優點清除有毒物質補充活性物質存在問題缺乏代謝功能血漿來源緊張限制應用優點具有合成、代謝和轉化功能關鍵技術與難點*缺乏理想肝細胞源缺乏高效生物反應器非生物型人工肝*Strain AJ,et al.Science,2002

23、,295：1005-9生物型/混合型人工肝是國內外研究的熱點混合型人工肝優點：整合兩者優勢關鍵技術與難點：二者有機結合的裝置及參數等問題內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室生物型/混合型人工肝國外研究現狀 國外 生物型/混合型人工肝起步于20世紀80年代后期 迄今有5種生物型/混合型人工肝進入IIII期臨床研究 國內 20世紀90年代后期，浙江、重慶、廣東、江蘇、北京等地相繼開展BAL、HAL研究研究熱點：安全、有效的人工肝用肝細胞源高效的生物反應器BAL、HAL系統優化及裝置研制內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室常規二步灌流法對大規模分離肝細胞的質量不理

24、想添加Hepes和Dispase等灌流液，進行四步灌流分離肝細胞獲滿意結果原代肝細胞分離方法的研究 四步灌流法的建立Dispase液灌流含Hepes的平衡鹽緩沖液預灌流EDTA液灌流膠原酶液灌流DNase洗滌液洗滌，收集肝細胞懸液四步灌流法和二步灌流法的流程圖灌流操作圖內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室四步灌流法提高了肝細胞活率（96%）、得率（5.3X107/g）和貼壁率（90%）申請發明專利：生物人工肝用豬和人肝細胞的制備方法(200410084625.7)、用于生產人工肝細胞的試劑(200410084626.1)、 一種肝細胞凍存液（200410089587.4） 新

25、方法為人工肝及細胞生物學研究提供高質量的肝細胞四步灌流法 二步灌流法新鮮分離的肝細胞培養24h后的肝細胞內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室 轉染篩選正常人肝細胞生物學功能鑒定永生化肝細胞克隆SV40LT-pcDNA3.1(-) 重組載體 建立人源性永生化肝細胞系HepLL 人源性永生化肝細胞系構建研究傳代培養已穩定傳 47 代HepLL具有原代肝細胞相似的生物學特征和功能呈肝板樣生長超微結構糖原染色陽性 HepLL在裸鼠脾內移植，表達肝細胞生物特性脾內細胞移植細胞呈島樣生長表達肝細胞特異抗原 內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室在建成HepLL基礎上，又建

26、立人源性永生化肝細胞系2株（HepLi2、3）和豬永生化肝細胞系3株（HepLP1、2、3）HepLL系列肝細胞系已被多家研究機構（上海交大、上海腫瘤研究所等）應用于科學研究人源性永生化肝細胞系為人工肝研究提供了潛在肝細胞源，并為肝細胞移植和體外藥物篩選提供新的細胞模型內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室利用經膠原改性的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)為構建仿生支架進行原代人肝細胞培養PLGA支架可明顯促進肝細胞的貼壁和增殖提高肝細胞白蛋白的合成、氨的清除與尿素合成肝細胞體外組織樣培養研究Li J, Li L, et al.ASAIO J. 2006; 52 (3): 321-

27、7. 內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室肝細胞體外大規模培養、凍存研究 可逆性永生化肝細胞評價肝細胞活性和功能肝細胞形態、超微結構肝細胞數量肝細胞的活率、貼壁率白蛋白合成量細胞色素P450酶活力（安定轉化試驗）等培養參數優化血清用量 接種的液體量培養基pH 細胞接種的初始數目等新型轉瓶培養系統 程序降溫、液氮儲存內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室微囊化肝細胞的大規模培養AC(海藻酸鈉殼聚糖)微囊包裹HepLL細胞置于轉瓶培養儀勻速旋轉培養Hep LL細胞隨著時間延長，集聚成球，逐漸增多增大微囊化肝細胞制作微囊化肝細胞轉瓶培養第6天第10天第15天微囊化H

28、epLL細胞核仁明顯，富含線粒體、內質網及糖原顆粒，可見緊密連接及毛細膽管樣結構毛細膽管樣結構細胞間緊密連接B富含內質網、線粒體內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室生物反應器研究理想生物反應器膜或支架材料等具有良好的生物相容性，便于肝細胞黏附、聚集良好的物質交換效能易于“放大”，能夠容納至少1010個肝細胞肝細胞與患者血漿（血液）進行物質交換的場所生物復合材料已經成為生物反應器研究的熱點之一生物人工肝系統構成示意圖內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室微囊化肝細胞懸浮培養反應器體外評價微囊化肝細胞懸浮培養反應器 微囊化肝細胞懸浮培養生物反應器：（正在進行體外評

29、價） 生物支架式生物反應器PLGA支架、PLGA/CS支架正在研究中（浙大高分子材化系合作）生物支架式反應器內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室 生物型人工肝動物實驗研究國家自然科學基金面上項目（編號：30270369）資助建立豬急性肝衰竭動物模型進行生物型人工肝療效和安全性評價研究豬肝組織呈現出血性壞死急性肝衰竭豬動物模型肝，X3700肝，HE，X200兩只豬正在接受BAL治療內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗室 生物型人工肝能有效地改善肝衰竭豬肝功能 生物型人工肝延長肝衰竭豬存活時間急性肝衰竭模型組：487h裝置對照組：438h人工肝治療組：10623hLi LJ, et al. Journal of Hepatology, 2006,24:317-324Li LJ, et al. International Journal of Artificial Organs, 2003 ,26:507-513專利一種雜合型人工肝裝置（ZL03255510.5）受試動物生存曲線 * 與AHF組、Sham BAL組比較，P 0.01 * 與AHF組、Sham BAL組比較，P 0.05 * 與AHF組、Sham BAL組比較，P 0.01* 與Sham BAL組比較，P 0.05 內科學（傳染病）國家重點學科 傳染病診治國家重點實驗