1、Sf-9細胞的培養及轉染Sf-9細胞Sf-9細胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年從細胞株IPLB-SF 21 AE得來的一個克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到的。Sf-9是半貼壁的細胞，貼壁性不強，可貼壁培養也可懸浮培養。Sf-9細胞的形態培養細胞生長的條件1、細胞的營養需要2、細胞的生存環境 溫度: 28 氧 pH: 7.2-7.4 滲透壓 3、無污染 4、無毒實驗材料：實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸生化培養箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：

2、培養瓶，吸管，電動吸引器，培養板， 凍存管超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環境。 生化培養箱生化培養箱設定的條件為28 。使用生化培養箱培養細胞時應注意的問題：1）保持培養箱內空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。2）箱內滅菌蒸餾水3000ml蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避免培養液蒸發。 培養瓶拿培養瓶的正確姿勢：拇指和食指夾住培養瓶，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平，防止培養液倒向瓶口。血球計數板細胞凍存和復蘇凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫

3、水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。慢凍程序標準程序： 當溫度在-25 以上時， 12 /min 當溫度達-25 以下時， 510 /min 當溫度達-100時，可迅速放入液氮中細胞凍存簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系 以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按 每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內降至 液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。細胞復蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅

4、速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內用培養液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。Sf9細胞的傳代判斷分離（散）細胞培養物是否需要傳代的主要指標就是觀察培養物是否已基本長滿培養瓶皿的底壁。一般來說，原代培養物未達到生長基質的80%表面面積，不要急于傳代，對于擬行首次傳代的培養物更如此。Sf9的分裂周期大概是27小時左右Sf9傳代的方法1）吸取或者傾出舊培養液。2）加入一定量的新培養基，用吸管吸取培養液，反復吹打瓶皿底壁，使半貼壁的細胞脫離瓶皿底壁。 吹打過程須有序進行，亦即要從一邊開始到另一邊結束，尤其是器皿的

5、邊緣地帶和四角處，確保瓶皿底壁各處的細胞均被吹打脫離。吹打時動作不宜過猛，吹出液體的力度要適中，否則會直接損傷細胞并產生能傷害細胞的氣泡。或者使細胞碎片增多。 經吹打后，得到細胞懸液。Sf9傳代的方法3）接種在新的培養瓶皿內。一般接種兩個或者多個培養瓶皿內。 有時候，傳代僅為了使培養物經歷并適應傳代處理過程，在培養物細胞數量不大的情況下，傳代時還只是接種在一個培養瓶皿內。加入培養液。（平時不做實驗時，只需要傳一瓶）。 （以1：5或更多為宜，每2-3天傳代一次） 28培養（不用CO2培養箱）。 4）送入培養箱中繼續培養。細胞培養換液對于像Sf9這樣的半貼壁的培養物，可按如下步驟操作：吸去或傾出（

6、部分或全部）舊培養液。加入新鮮的培養液。加入的量與換液前的量相同。放回原來的培養箱中繼續培養。轉染轉染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程?；瘜W包括：DEAE-葡聚糖法磷酸鈣法人工脂質體法物理包括：顯微注射電穿孔基因槍*BacmidBac-to-Bac expression system桿狀病毒表達系統（Baculovirous Expression Vector System,BEVS）與細菌，酵母，哺乳動物細胞一起被公認為當今世界的基因工程的四大表達系統。特點能對高效表達的蛋白質進行較完善的翻譯后加工，如糖基化，磷酸化，酰基化，信號肽的切除等；與

7、其他真和細胞表達系統相比能獲得重組蛋白的高水平表達，最高甚至可達到細胞總蛋白的50%；對脊椎動物無感染性，并且也已經證明它們的啟動子在大多數的哺乳動物細胞中也是沒有活性的，因此這對于表達一些致癌基因和潛在的毒蛋白比其他的表達系統更有優勢；能容納大分子片段的插入和表達；能同時在一個細胞和載體上表達多個外源基因；能保證高表達的外源蛋白在細胞內進行正確的折疊，二硫鍵的搭配等。桿狀病毒現已知基因組全序列的桿狀病毒僅有7 種: 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒( AcMNPV ) 家蠶核多角體病毒( BmNPV ) 黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒( LdMNPV

8、) 甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒( SeMNPV) 棉鈴蟲核型多角體病毒( HaNPV) 斜紋夜蛾核型多角體病毒( SpltMNPV) 多角體蛋白多角體蛋白是形成包含體（在顯微鏡下可以識別的病毒合成和積貯的部位，常是細胞內的病毒晶體。它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體，包含大部分的表達蛋白。 ）的主要成分，感染后期在細胞中的積累可高達30% 50%，是病毒復制非必需成分，但對病毒粒子卻有保護作用，可使之保持穩定和感染能力。Bacmid能快速、高效產生的重組AcMNPV 病毒。取桿狀病毒( baculovirus) 和質粒( plasmid) 的英文字頭字尾命名為Bacmid，即桿狀病毒質粒之意。該載體可像質粒一樣在大腸桿菌中生長，又對鱗翅目昆蟲細胞具有感染性。昆蟲桿狀病毒表達系統的構成表達過程：1、將外源目的基因插入到啟動子下游與桿狀病毒重組，獲得重組病毒（酶切酶連轉化）2、將重組的病毒純化3、感染昆蟲細胞或蟲體（轉染）4、外源基因隨著病毒的復制而獲得表達*人細小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac系統中的表達及其反應原性*Bac-toBac Baculovirus Expression S