1、 物質的提取質粒DNA的提取1、 實驗原理：質粒是存在于染色體外、能獨立復制的雙鏈閉合的環狀DNA分子，以超螺旋的形式存在。在高pH值得NaOH和SDS溶液中，細菌細胞壁破裂，蛋白質和DNA發生變性。當加入中和溶液后，變性的染色體DNA與蛋白質纏繞形成大型復合體，被SDS包蓋，當K 取代Na 時，這些復合體會沉淀下來；而質粒DNA雙鏈能夠迅速復性，呈溶解狀態，留在上清液中。在上清液中加入乙醇，通過離心就可使質粒DNA沉淀下來。2、 實驗步驟 1.取1.5ml菌液，室溫下，12 000rpm，離心30秒。 2.棄上清，留沉淀，加入150l冰預冷的溶液I（已加入RNase A），劇烈震蕩，重懸沉淀

2、。 3.加入150l新配置的溶液II，快速顛倒混勻5次（注意：切勿震蕩！），置于冰上。 4.加入200l冰預冷的溶液III，反復顛倒數次混勻，冰浴5分鐘。室溫下，12 000rpm，離心5分鐘。 5.取上清，轉移到另一EP試管中，加等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），顛倒混勻有機相和水相，室溫下，12 000rpm，離心5分鐘。 6.將上清轉移到另一EP試管中，加等體積氯仿：異戊醇（24:1），顛倒混勻，室溫下，12 000rpm，離心2分鐘。 7.將上清轉移到另一EP試管中，加兩倍體積冰預冷的無水乙醇，顛倒數次混勻，冰浴1015分鐘后，室溫下，12 000rpm，離心15分鐘。 8.棄

3、上清，留沉淀，加1ml75%乙醇洗滌，12 000rpm，離心2分鐘。 9.棄上清，室溫下，12 000rpm，離心30s，吸除乙醇，室溫干燥，使酒精充分揮發。 10.加20l TE，溶解沉淀。3、 實驗討論 1.離心機需配平離心。 2.加入溶液III后，溶液中出現絮狀物，可以多離心1分鐘使溶液與絮狀物分離更徹底。 3.加入的酚使蛋白質迅速變性，氯仿與異戊醇增強極性，純化酚，同時進行有機抽提。 4.再次加入的氯仿與異戊醇為去除酚對實驗后續產生的影響。 5.溶液I使沉淀重懸，其中Tris-Cl（pH8.0）為緩沖液；EDTA（pH8.0）為金屬螯合劑，防止DNA酶作用；RNase A則降解RNA

4、。 6.溶液II為實驗提供堿性環境并裂解細胞。 7.溶液III中和溶液II并使質粒DNA復性；其中KAC與SDS結合后離子置換成鉀鹽，因其水溶性低可以后續去除。 8.質粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術，但提取方法有很多種，以下介紹一 種最常用的方法： 1）堿裂解法：此方法適用于小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀 染序列分析。方法如下：1、接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2ml LB培養基。2、37振蕩培養過夜。3、 取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。 4、加0.lml溶液I(1葡萄糖，50mM/L EDTA pH

5、8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1 SDS)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管。8、加入等體積的異戊醇，混勻后于?0靜置10min。 9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。10、用70乙醇05ml洗滌一次，抽干所有液體。11、待沉淀干燥后，溶于005mlTE緩沖液中。 2）煮沸法 1、將1.5ml培養液倒入eppen

6、dorf管中,4下12000離心30秒。 2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。 5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量離心機4下12000g離心10分鐘。 7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。8、取20ml進行電泳檢查。 質粒DNA的大量提取和純化。 *在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒 DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析

7、法和氯化絕梯度離心法。 3）堿法1、取培養至對數生長后期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管 倒置使上清液全部流盡。2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10分鐘。 6、加9ml用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15分鐘,此時應形成白色絮狀沉淀。 7、4下5000g離心15分鐘。 8、取上清液,加入50ml RN

8、A酶A(10mg/ml), 37水浴20分鐘。9、 加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4下12000g離心10分鐘。 10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4下12000g離心10分鐘。 11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。 12、4下12000g離心15分鐘, 沉淀用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4下12000g離心5分鐘。13、 真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。小鼠肝組織總RNA的提取（Trizol法）1 實驗原理Trizol是由異硫氰酸胍和苯酚配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解

9、的過程中，能在破碎細胞、降解細胞其他成分的同時保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉移后用異丙醇沉淀RNA。2 操作步驟 1.取50100mg新鮮小鼠肝組織置于用DEPC 水處理過的玻璃勻漿管中，加入1ml Trizol充 分勻漿，室溫靜置5分鐘，4攝氏度，12000rpm離心10分鐘。 2.上清液移至一新的用DEPC處理過的1.5ml離心管中，加入氯仿至1.5ml，劇烈震蕩15秒， 室溫靜置2分鐘。4攝氏度，12000rpm離心15分鐘。 3.小心將上清液無色水相移至一新的離心管（DEPC處理）中，加入異丙醇至1.5ml，顛倒 混勻數次，室溫靜置10分鐘，放入

10、冰箱保存待用。 4.加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4攝氏度，7500rpm離心5分鐘，棄上清。 5.晾干沉淀（不要過干，否則不易溶解），加入20lDEPC 水溶解RNA。3 注意事項 1.提取RNA時最關鍵的因素是盡量避免RNA酶的污染。在實際的操作中應遵循以下指南： （1）全程佩戴一次性手套。皮膚經常帶有細菌和真菌，可能污染RNA的抽提并提成為 RNA酶的來源。 （2）使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導致的 RNA酶交叉污染。 （3）玻璃器皿在洗干凈并用蒸餾水沖洗后，在150攝氏度的烘箱中烘烤6小時。 2.實驗中各步操作在冰浴中進行。 3.酚具有高

11、度腐蝕性，容易引起嚴重的灼傷。在操作過程中，如果皮膚沾污了酚，應立即 用水徹底沖洗，并用肥皂或稀釋的蘇打水洗滌。切記不能用酒精擦洗。4 實驗討論 1.DEPC是強烈的烷化劑，通過與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制RNA酶活 性，是消除外源性RNA酶的主要方法。但CEPC有致癌作用，并具有很強的反應性，因 此注意： 使用時，不直接接觸 DEPC處理的器皿和水必須經高壓滅菌處理，使DEPC分解后使用。 為避免酶蛋白反復凍溶而失去活性，酶制劑溶于50的甘油中，-20oC儲存可保持液 狀。但高濃度的甘油對酶促反應有抑制作用，因此酶的用量不能超過反應體積的1/10。 在進行各種酶促反應時，應首

12、先加水，再加入其它成分，最后加酶。 2.為何無RNA沉淀：勻漿不完全時，基因組DNA分子仍然很大，溶液粘稠。變性的蛋白質和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地釋放到溶液中。 3.RNA抽提率低的原因：樣品均化或裂解不完全: 勻漿不完全時，RNA分子易被蛋白質和基因組DNA復合物包裹，不能被有效釋放。終RNA不完全溶解:未溶解的RNA丟失。 4.RNA降解原因：從動物體取下的組織沒有立即進行抽提或冰凍保存。水溶液或試管污染有RNA酶。加氯仿后離心收集上清時，吸到中間蛋白質。操作時沒戴手套，口罩。 5.DNA污染的原因：樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。 人組培組織基因

13、組DNA的提取 一、實驗目的 真核生物基因組DNA的提取2、 實驗原理真核生物基因組DNA以核蛋白形式存在于細胞核中，制備DNA的原則是既要將蛋白質、脂類、糖類等物質分離干凈。又要盡可能保持DNA分子的完整。為了從組織中獲得純凈和大分子量的DNA，本實驗中聯合采用勻漿、蛋白酶K和去污劑溫和處理法。在提取DNA的反應體系中，勻漿起到破壞細胞膜和核膜的作用，SDS進一步協助破膜過程，并將組蛋白從DNA分子上拉開。SDS及EDTA抑制細胞中DNA酶的活性，蛋白酶K將所有蛋白降解成小肽和氨基酸，隨后用酚-氯仿抽提，將蛋白質和DNA分離，得到較純的DNA分子。3、 操作步驟 1.取動物新鮮組織約50mg

14、，用預冷的生理鹽水洗去表面殘血，剪碎，加入45l STE裂解液和50l 10% SDS至濃度為0.5%，勻漿后再加入10mg/ml的蛋白酶K 5l至終濃度為100l/ml，置55水浴箱保溫3小時。（老師預先準備） 2.取500l反應液加入等體積TrisCl（pH8.0）飽和酚，顛倒混勻10分鐘，4000rpm離心5分鐘。 3.取上層粘稠水相，加入酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）溶液至1ml，顛倒混勻10分鐘，4000rpm離心5分鐘。 4.取上層水相，加氯仿：異戊醇（24:1）溶液至1ml，顛倒混勻5分鐘，4000rpm離心5分鐘。 5.取上層水相，加1/10體積pH5.2的3M NaAC，

15、加入預冷的無水乙醇至1ml，緩慢搖動均勻，可見乳白色絲狀DNA沉淀出現，12 000rpm離心15分鐘。 6.棄上清，向沉淀中加75%乙醇500l漂洗，12 000rpm離心3分鐘。 7.棄上清，沉淀室溫干燥，加入100lTE溶解。4、 實驗討論 1、 裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解. 2、 酚一定要堿平衡.苯酚具有高度腐蝕性,飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷,因此應注意防護.氯仿易燃、易爆、易揮發,具有神經毒作用,操作時應注意防護. 3、 各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解. 4、 取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾. 5、 異丙醇,乙醇.NaA

16、c,KAc等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀. 6、 提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理. 7、 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制. 8、分離純化核酸總的原則： 應保證核酸一級結構的完整性；排除其它分子的污染（蛋白質、脂類、糖、有機溶劑、金屬離子、外源DNA、RNA等） 。 9、核酸純化應達到的要求： 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。 10、核酸制備時應注意的事項: 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學因素對核酸的降解（如過量

17、酸堿） 減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力（強烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復凍融）和高溫 防止核酸的生物降解（核酸酶的預防） 。 11、核酸制備中常用的蛋白質變性劑 蛋白質變性劑的作用： 使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。 使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 某些蛋白質變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC 12、DNA提取常見問題 DNA樣品不純，抑制后續酶解和PCR反應。 原因：（1）DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質 （2）DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續酶解反應 （3）DNA中殘留有金屬離子 對策：（

18、1）重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質 （2）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發 （3）增加70乙醇洗滌的次數（2-3次） DNA降解 原因：（1）材料不新鮮或反復凍融 （2）未很好抑制內源核酸酶的活性 （3）提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷 （4）外源核酸酶污染 （5）反復凍融 對策：（1）盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融 （2）液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液 （3）在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量 （4）細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔 （5）所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌 （6）將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復

19、凍融 DNA提取量少 原因：（1）實驗材料不佳或量少 （2）破壁或裂解不充分 （3）沉淀不完全 （4）洗滌時DNA丟失 對策：（1）盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 （2）動植物要勻漿研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁 （3）高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量） （4）低溫沉淀，延長沉淀時間 （5）加輔助物，促進沉淀 （6）洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 人-actin基因片段的PCR擴增1、 實驗原理 PCR技術是在模板DNA、引物、和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，TaqDNA聚合酶催化的DNA體外擴增方法，用于檢測微量DNA。PCR技術的特異性

20、決定于引物和模板結合的特異性。反應過程如下：（1） 變性：通過熱變性95度DNA雙鏈之間的堿基氫鍵斷裂形成單鏈DNA。（2） 退火：在溫度降低的情況下，模板DNA通過堿基互補與引物形成雜交鏈，實驗所用的溫度為五十五度。（3） 延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷酸及鎂離子的存在下，一引物為起點，沿5到3的方向合成DNA新鏈。以上三個步驟為一個循環，每一個循環的產物作為下一個循環的模板，進行36個循環后，兩個引物之間的片段得到了大量的擴增。人-actin為細胞內比較穩定的蛋白質，其基因總長為3065bp，含六個外顯子和5個內含子，實驗選用第四個外顯子的部分設計引物。上游引物：5-GAGACCT

21、TCAACACCCCAGCC-3下游引物：5-TCAGGGCAGCGGAACCGCTCA-3通過PCR擴增，使其之間的404bp的片段得以大量擴增。2、 操作步驟 （1） 在無菌dorf管中依次加入PCRmax17l、引物1 1l、引物2 1l、模板1l，總體積為20l. 將反應緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶混合后再加入溴酚藍指示劑共17l稱為PCRmax。（2） 離心混勻后，將dorf管放入PCR儀。（3） 進行擴增，反應條件為： 1）九十五度預變性五分鐘。 2）九十四度變性40秒，五十五度退火40秒，七十二度延伸1分鐘，循環36次。3） 七十二度延伸5分鐘。 三、實驗討論1. 引物有

22、多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據需要必須做不同的選擇。2. 緩沖液的成分最為復雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據反應體系確定，除特殊情況外不需調整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。3. 引物設計的基本原則引物長度：15-30bp，常用為2

23、0bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內部不應出現互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 端的互補重疊。引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。、4

24、. PCR技術的特點 特異性強，靈敏度高，簡單快速5. 常見問題1）假陰性不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量及溴乙錠的使用， PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。2）假陽性出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更

25、整齊，亮度更高。3)出現非特異性擴增帶PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93變性，65左右退火與延伸）。4) 出現片狀拖帶或涂抹帶5) PCR擴增有時

26、出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。物質的鑒定將上三次實驗中得到的質粒DNA、小鼠肝臟RNA、PCR擴增所得的產物在凝膠電泳上鑒定一、瓊脂糖凝膠電泳鑒定 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，應選用電泳純的，瓊脂糖此級產品篩除了抑制物和核 酸酶，而且用溴化乙錠染色后熒光背景最小。 (1)瓊脂糖凝膠電泳裝置 由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高，而適應性又強，在過去20年里已成功地設計了形形色色及大大小小 的電泳槽。對這些裝置的選擇主要是依據個人的喜惡。使用最普遍的裝置是Walter Schaffner發明的水 平板凝膠。 水平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺的玻璃板或塑料盤上灌制。在有些裝置中，則可將凝膠直 接鋪在平臺上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同，所以有 相當一部分的電流將通過凝膠的全長。 （2）瓊脂糖凝膠的制備 瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫凝膠的電