1、u DNA序列是遺序列是遺傳信息的貯存者傳信息的貯存者，它通過自主復(fù)，它通過自主復(fù)制得到永存，并制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成通過轉(zhuǎn)錄生成mRNA、翻譯生、翻譯生成蛋白質(zhì)的過程成蛋白質(zhì)的過程來控制生命現(xiàn)象來控制生命現(xiàn)象中心法則（the central dogma)：指生物體內(nèi)遺傳信息的傳遞方向第第13章章 DNA的生物合成的生物合成 (DNA Replication) 理解半保留機制和半不連續(xù)復(fù)制理解半保留機制和半不連續(xù)復(fù)制 掌握細菌掌握細菌DNA復(fù)制過程及酶的作用復(fù)制過程及酶的作用 掌握真核生物掌握真核生物DNA復(fù)制特點復(fù)制特點 掌握掌握DNA復(fù)制的類型復(fù)制的類型 掌握逆轉(zhuǎn)錄的特點掌握逆轉(zhuǎn)錄的特

2、點DNA合成復(fù)制（最主要的,DNADNA）逆轉(zhuǎn)錄（RNADNA）DNA的修復(fù)DNA重組技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體內(nèi)體外復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制(replication)親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈 DNA分子為模板，按照堿基配對原則合成子代DNA分子的過程。 DNA復(fù)制的體系 模板：DNA的兩條單鏈 底物：dNTP 引物：提供3-OH的小片段RNA 酶：DNA聚合酶、引物酶、拓撲異構(gòu)酶、解旋酶、SSB、DNA連接酶等。一. DNA復(fù)制的特點（一）半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制（一）半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制1. 半保留復(fù)制： DNA復(fù)制時，新合成的子代DNA與親代完全相

3、同，且一條鏈來自親代DNA，一條鏈是新合成的 。Meselson & Stahl, 1958同位素15N標記CsCl密度梯度離心實驗。首先驗明了DNA的半保留復(fù)制的假說。Meselson & Stahl, 1958解鏈方向2. 半不連續(xù)性復(fù)制3 5 3 5 353535 前導(dǎo)鏈 后隨鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：DNA復(fù)制時，與復(fù)制叉移動方向一致，以35鏈為模板，按53方向連續(xù)合成的一條鏈5335后隨鏈：DNA復(fù)制時，與復(fù)制叉移動方向相反，以53鏈為模板，按53方向不連續(xù)合成的一條鏈。DNA復(fù)制的體系 模板：DNA的兩條單鏈 底物：dNTP 引物：提供3-OH的小片段RNA 酶：DNA聚合

4、酶、引物酶、拓撲異構(gòu)酶、解旋酶、SSB、DNA連接酶等。（二）（二） DNA復(fù)制的相關(guān)蛋白復(fù)制的相關(guān)蛋白以單鏈DNA為模板，催化dNTP合成DNA，其活性需要Mg2+。活性：活性：l53 的聚合酶活性l核酸外切酶活性：3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性1. DNA聚合酶聚合酶（DNA-pol） DNA聚合酶聚合酶 5 3 聚合酶活性聚合酶活性DNA聚合酶聚合酶 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶聚合酶 5 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G

5、 C G A C 5核酸外切酶活性的應(yīng)用3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性?能切除引物和突變的 DNA片段。能辨認復(fù)制中錯配的堿基對，并將其水解。(校對活性)Apol Ipol IIpol III亞基種類17105 聚合酶活性+ + 5 外切酶活性+5 外切酶活性+-持續(xù)合成能力32001500500000功能修復(fù)、切除引物修復(fù)復(fù)制原核生物的DNA聚合酶(1) DNA pol種類 核心酶： ， 全酶：是一個異二聚體復(fù)合物，其中一個單體合成前導(dǎo)鏈，另一個合成后隨鏈；保證兩條鏈以相同的速度進行合成DNA聚合酶IIIpol polpolpol pol 5 聚合酶活性+ + 5 外切酶活性-+5

6、外切酶活性-引物酶活性+-功能合成引物修復(fù)線粒體DNA復(fù)制復(fù)制修復(fù)修復(fù)持續(xù)合成能力中等低高有PCNA時高高抑制劑蚜腸霉素雙脫氧TTP雙脫氧TTP蚜腸霉素蚜腸霉素存在區(qū)域 細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核真核生物（哺乳動物）的DNA聚合酶2. 引引物物酶（酶（primase）作用：復(fù)制起始時催化生成短鏈RNA引物本質(zhì)：是一種RNA聚合酶 如：Dna G蛋白（E.coli） DNA聚合酶（真核生物）解旋酶：二聚體或六聚體 利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。 例如：E.coli的Rep蛋白 3. DNA解解鏈酶（鏈酶（DNA helicase）拓撲異構(gòu)酶 DNA復(fù)制時，負責調(diào)整

7、DNA超螺旋的圈數(shù)。拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶(Top) 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶(Top ) ATP供能供能-+負螺旋負螺旋 消除和減少消除和減少 引入引入2個個切斷方式切斷方式雙鏈中的一條雙鏈中的一條雙鏈雙鏈定位定位轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)相關(guān)功能相關(guān)功能轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制 DNA拓撲異構(gòu)酶& ：4. 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶（DNA topoisomerase）生理功能： 維持單鏈狀態(tài)，防止復(fù)性； 對抗核酸酶水解，保護單鏈完整。作用原理： SSB可結(jié)合32個核苷酸單位，可循環(huán)利用。5. 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(SSB)SSB蛋白能刺激同源的DNA聚合酶活力

8、p DNA連接酶（ligase）： 消耗能量（ATP或NAD+），催化相鄰的DNA片段之間形成3,5-磷酸二酯鍵；6. DNA連接酶連接酶35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+ 大腸桿菌的DNA連接酶：不能連接兩條游離的DNA單鏈。 T4 DNA 連接酶：可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。DNA復(fù)制的酶學(xué)小結(jié)E.coli復(fù)制起始點 oriC（長約245bp)三個三個13bp序列序列DnaA蛋白結(jié)合位點蛋白結(jié)合位點四個四個9bp序列序列1、復(fù)制起點ori p E.coli 的起點為ori C，約245 bp

9、，含兩組短的重復(fù)序列，富含AT和回文對稱序列。（三） 復(fù)制起點與方向早期回文序列富含AT富含ATSV40起點酵母起始位點(自主復(fù)制序列ARS)真核生物的復(fù)制原點的研究是以酵母為基礎(chǔ)的11bp的保守序列富含ATp 酵母的自主復(fù)制序列ARS：能指導(dǎo)DNA復(fù)制的起始)SV40起點17bp的富含AT區(qū)p 猴病毒SV40復(fù)制原點早期回文序列27bp的T-抗原結(jié)合位點：有回文序列復(fù)制原點的三個共同特征： l 含多個短重復(fù)順序；l 這些短重復(fù)序列被多聚原點結(jié)合蛋白所識別；l oriC富含AT，使復(fù)制起點區(qū)易于解鏈以發(fā)動DNA復(fù)制。2、復(fù)制子及復(fù)制方向u 復(fù)制子（replicon)：基因組中能獨立進行DNA復(fù)

10、制的單位。包含一個復(fù)制起點。u 復(fù)制方式：雙向?qū)ΨQ、雙向不對稱、單向復(fù)制；真核生物復(fù)制復(fù)制子真核：多個起點 多個復(fù)制子原核生物復(fù)制原核：一個起點 一個復(fù)制子E.coli 環(huán)復(fù)制真核生物的復(fù)制3、延伸方向：53DNA/RNA: 5 3蛋白質(zhì): NC4、部分生物DNA的復(fù)制速率復(fù)制速度：原核快、真核慢。二、原核生物DNA復(fù)制（一）原核生物DNA復(fù)制的過程1. DNA復(fù)制的起始2. DNA復(fù)制鏈的延伸3. DNA復(fù)制的終止以大腸桿菌DNA復(fù)制為例： DnaA 識別并結(jié)合復(fù)制起點，DnaBDnaC六聚體與oriC 形成預(yù)引發(fā)體； DnaG加入形成引發(fā)體，合成引物RNA； 有關(guān)酶和蛋白及DNApol 組

11、裝到引發(fā)體上，組裝形成復(fù)制體。1. DNA復(fù)制的起始引發(fā)復(fù)制復(fù)制起點DnaA單體結(jié)合在9bp重復(fù)處6個DnaC單體與1個DnaB六聚體結(jié)合形成DnaB/DnaC復(fù)合體DNA雙鏈在13bp重復(fù)處分開20-40DnaA聚合呈大團復(fù)制體復(fù)制體引發(fā)體引發(fā)體2. 復(fù)制的延長 在DNA pol催化下，dNTP逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是3,5-磷酸二酯鍵的生成。大腸桿菌延長DNA的主要酶是DNA pol 岡崎片段合成開始岡崎片段合成終止聚合酶和滑動鉗解聚滑動鉗聚集后隨鏈的合成 核心酶與滑動鉗不斷分離和聚合來合成岡崎片段.后隨鏈的復(fù)制 DNA pol I (53外切酶活性)去除引物DNA po

12、l I (53聚合酶活性)填補空隙DNA 連接酶(NAD+)連接切口5353E E.coli 有兩個ter終止區(qū)域，分別結(jié)合專一性的tus蛋白，共同阻止復(fù)制叉的進程。 序列一：terE terD terA 序列二：terB terC terF terG ter位點序列只引起一個方向的終止。 tus基因產(chǎn)物是一種DnaB解旋酶的抑制劑。3. 復(fù)制的終止細菌細菌DNA復(fù)制過程復(fù)制過程 （二）其他環(huán)狀DNA分子的復(fù)制 起始方式： 從頭起始（denovo initiation）: 復(fù)制、D環(huán)復(fù)制 共價延伸（covalent extesion） 滾環(huán)復(fù)制1. 復(fù)制中的大腸桿菌染色體在電鏡下可看到形狀，因

13、此也稱復(fù)制。例如：絕大部分革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒、多瘤病毒等環(huán)狀DNA采用復(fù)制。2. 滾環(huán)復(fù)制 滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生一個切口，切口的3-OH末端被DNA聚合酶延伸，新合成的鏈與模板鏈互補結(jié)合在一起而替換原來的親代鏈。 例如：M13噬菌體、 X174、細菌F因子X174：單鏈環(huán)狀DNA噬菌體，該單鏈為“+”鏈，在復(fù)制早期，以“+”鏈為模板合成”-“鏈，連接后形成雙鏈閉合環(huán)狀DNA(稱為復(fù)制型，RF)RF型+鏈-鏈A蛋白切割復(fù)制原點3. D環(huán)復(fù)制 兩條鏈的合成高度不對稱,一條鏈迅速合成出互補鏈,另一條則形成游離的單鏈環(huán)(D-環(huán))e.g.線粒體DNA H鏈上的原點( (細胞周期細胞周期

14、) )G1G1 preparing for DNA replication (cell growth)S SDNA replicationG2a short gap before mitosisMmitosis and cell division三、真核生物DNA的復(fù)制(DNA replication in Eukaryote) 1. 復(fù)制起始v 約20-50個復(fù)制子成簇在S期的特定時間同時開始復(fù)制。v S期的早期：常染色質(zhì)的復(fù)制。v S期的晚期：異染色質(zhì)的復(fù)制，被激活。v 中心粒的和端粒的DNA最后復(fù)制。2. 復(fù)制叉形成和延伸 DNA從核小體上解旋的速度為50bp/s，需要解旋酶和 RP-A

15、的存在。 由引物酶和行駛聚合酶功能的DNA pol起始兩條鏈的合成，DNA pol進行DNA子鏈的延伸。端粒(telomere)：真核生物線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，常膨大成顆粒狀。3. 端粒與 端粒酶(telomere and telomerase) 功能 維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性； 維持DNA復(fù)制的完整性。（1）端粒結(jié)構(gòu)特點 由端粒DNA序列和端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成。 端粒DNA是非編碼的短串聯(lián)重復(fù)序列，富含G/T例：四膜蟲的端粒DNA 5-TTGGGGTTGGGG(TTGGGG)nTTGGGG-33-AACCCCAACCCC-5 是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末

16、端DNA鏈進行延長。 組成：端粒酶RNA端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（2） 端粒酶端粒的合成機制：不依賴模板，以爬行方式合成。母鏈通過非標準堿基配對回折DNA聚合酶復(fù)制子鏈端粒合成完成進一步加工 端粒及端粒酶的生理意義成年人端粒比胚胎細胞端粒短；老化與端粒酶活性下降有關(guān)；腫瘤的發(fā)生與端粒酶活性有關(guān)；原核與真核生物DNA復(fù)制的差異點一般性質(zhì)比較原核生物真核生物復(fù)制起點單起點多起點復(fù)制子大而少小而多復(fù)制叉移動速度900bp/s50bp/s岡崎片段10002000bp100200bp引發(fā)策略引發(fā)酶產(chǎn)生引物，由pol延伸由pol 開始，由pol 完成復(fù)制多聚酶單體有不同進行性的異源二聚體每條鏈有不同的

17、酶，有不同的進行性拓撲學(xué)疏松和卷曲之間存在平衡，凈為負超螺旋濃縮在核小體中的負超螺旋，高級結(jié)構(gòu)影響拓撲學(xué)第二輪復(fù)制第一輪未結(jié)束就可以開始第二輪復(fù)制復(fù)制許可因子調(diào)控，復(fù)制周期不可重疊末端環(huán)狀分子，末端不縮短線形分子，末端會縮短端粒酶-+原核與真核生物DNA復(fù)制的差異點復(fù)制體成分比較原核生物真核生物復(fù)制聚合酶pol pol /pol 進行性因子pol 的夾子PCNA引物酶DnaGpol 的引發(fā)酶解鏈酶DnaBT 抗原引物去除RNaseH和pol RNaseH1和MF-1后隨鏈修復(fù)pol 和DNA連接酶pol 和DNA連接酶拓撲異構(gòu)酶旋轉(zhuǎn)酶Topo 單鏈結(jié)合SSBRF-A四、確保DNA復(fù)制忠實性的機

18、制u 半保留復(fù)制u DNA聚合酶對模板和引物的識別作用u DNA聚合酶精細的空間結(jié)構(gòu)u DNA聚合酶對堿基的選擇作用u DNA聚合酶的校正作用u RNA引物的合成和切除u 錯配修復(fù)系統(tǒng)1. 逆轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription) 在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以RNA為模板合成DNA的過程。是RNA病毒的復(fù)制形式。 五、逆 轉(zhuǎn) 錄2. 逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 從RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，催化以RNA為模板合成雙鏈DNA的酶，稱為依賴RNA的DNA聚合酶(RDDP)p 活性： RNA指導(dǎo)的DNA聚合活性 DNA指導(dǎo)的DNA聚合活性 RNase H活性（專一水解RN

19、A-DNA雜交分子中的RNA，可沿5 3 水解RNA）逆轉(zhuǎn)錄酶對DNA無3-5的外切酶活性，因此無校對功能，逆轉(zhuǎn)錄的錯誤率相對較高，這可能是瘤病毒較快出現(xiàn)新病毒株的一個原因。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的復(fù)制與基因表達逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制與表達逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組復(fù)制過程o引物為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝時從宿主細胞獲得的空載tRNA分子。(一些鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒以宿主tRNATrp為引物，而鼠類逆轉(zhuǎn)錄病毒則以宿主細胞tRNAPro為引物)o在逆轉(zhuǎn)錄過程中，新合成的DNA鏈要發(fā)生兩次“跳躍”，以改變鏈間堿基配對的位置，使雙鏈DNA的兩端產(chǎn)生相同的長末端重復(fù)序列LTR 。oLTR中含有整合信號、轉(zhuǎn)錄信號（啟動子）、增強子和poly A位點等序列，通常只有左側(cè)LTR中的啟動子和右側(cè)LTR中的polyA位點發(fā)揮正常功能，這是由它們所在的位置所決定的。引物結(jié)合于5PB區(qū)合成強終止負鏈DNA合成的負鏈DNA并不是全長，缺少3U54. 合成岡崎片段不需要（ ）A. dNTP B. DNA連接酶 C. 引物酶 D. DNA聚合酶2. DNA復(fù)制時，模板序列是-pTAGA-，將合成的互補結(jié)構(gòu)是（ ）A. -pTCTA- B. -pATCA- C. -pUCUA- D. -pGCGA-DNA合成的原料為（合成的原料為（ ）A. dATP、dCTP、dGTP、dTT