1、生物多樣性依賴于：生物多樣性依賴于：DNADNA突變突變DNADNA修復修復平衡平衡DNA損傷與修復損傷與修復 DNA Damage and Repair第十五章第十五章 各種體內外因素所導致的各種體內外因素所導致的DNA組成與結構的組成與結構的變化稱為變化稱為DNA損傷（損傷（DNA damage） 其一，其一，DNA的結構發生永久性改變，即的結構發生永久性改變，即突變突變其二，其二，導致導致DNA失去作為復制和失去作為復制和/或轉錄或轉錄的模板的功能的模板的功能 DNA損傷的后果損傷的后果:一、多種因素通過不同機制導致一、多種因素通過不同機制導致DNA損傷損傷（一）體內因素（一）體內因素

2、DNA復制錯誤復制錯誤 DNA自身的不穩定性自身的不穩定性 機體代謝過程中產生的活性氧機體代謝過程中產生的活性氧第一節第一節 DNA損傷損傷DNA DamagenDNA復制錯誤：復制錯誤：n在在DNADNA復制過程中，堿基的異構互變、復制過程中，堿基的異構互變、4 4種種dNTPdNTP之間濃度之間濃度的不平衡等均可能引起堿基的錯配的不平衡等均可能引起堿基的錯配nDNADNA復制的錯配率約復制的錯配率約1/101/101010n復制錯誤還表現為片段的缺失或插入。復制錯誤還表現為片段的缺失或插入。n特別是特別是DNADNA上的短片段重復序列，在真核細胞染色體上廣上的短片段重復序列，在真核細胞染色

3、體上廣泛分布，導致泛分布，導致DNADNA復制系統工作時可能出現復制系統工作時可能出現“打滑打滑”現象，現象，使得新生成的使得新生成的DNADNA上的重復序列拷貝數發生變化。上的重復序列拷貝數發生變化。 nDNA自身的不穩定性自身的不穩定性 ：nDNADNA結構自身的不穩定性是結構自身的不穩定性是DNADNA自發性損傷中最頻繁和自發性損傷中最頻繁和最重要的因素。最重要的因素。n當當DNADNA受熱或所處環境的受熱或所處環境的pHpH值發生改變時，值發生改變時， DNADNA分子上分子上連接堿基和核糖之間的糖苷鍵可自發發生水解，導致堿基連接堿基和核糖之間的糖苷鍵可自發發生水解，導致堿基的的丟失丟

4、失或或脫落脫落，其中以，其中以脫嘌呤脫嘌呤最為普遍。最為普遍。n含有氨基的堿基還可能含有氨基的堿基還可能自發脫氨基反應自發脫氨基反應，轉變為另一種堿，轉變為另一種堿基，即基，即堿基的轉變堿基的轉變，如，如C C轉變為轉變為U U，A A轉變為轉變為I I（次黃嘌呤）（次黃嘌呤）等。等。n物理因素：物理因素：電離輻射、紫外線電離輻射、紫外線(ultra violet, UV)（二）體外因素（二）體外因素 物理因素物理因素 化學因素化學因素 生物因素生物因素n化學因素：化學因素：自由基導致的自由基導致的DNADNA損傷損傷堿基類似物導致的堿基類似物導致的DNADNA損傷損傷 堿基修飾劑、烷化劑導致

5、的堿基修飾劑、烷化劑導致的DNADNA損傷損傷 嵌入性染料導致的嵌入性染料導致的DNADNA損傷損傷 n堿基損傷與糖基破壞：堿基損傷與糖基破壞：化學毒物可通過對堿基的某些基團進行修飾而化學毒物可通過對堿基的某些基團進行修飾而改變堿基的性質。改變堿基的性質。由于堿基損傷或糖基破壞，在由于堿基損傷或糖基破壞，在DNADNA鏈上可能形鏈上可能形成一些不穩定點，最終可導致成一些不穩定點，最終可導致DNADNA鏈的斷裂。鏈的斷裂。二、二、DNA損傷的類型損傷的類型n堿基之間發生錯配堿基之間發生錯配 ：堿基類似物的摻入、堿基修飾劑的作用可改變堿基類似物的摻入、堿基修飾劑的作用可改變堿基的性質，導致堿基的性

6、質，導致DNADNA序列中的錯誤配對。序列中的錯誤配對。在正常的在正常的DNADNA復制過程中，存在著一定比例的復制過程中，存在著一定比例的自發堿基錯配。自發堿基錯配。最常見的是組成最常見的是組成RNARNA的尿嘧啶替代胸腺嘧啶摻的尿嘧啶替代胸腺嘧啶摻入到入到DNADNA分子中。分子中。nDNA鏈發生斷裂：鏈發生斷裂：n電離輻射電離輻射、化學毒劑化學毒劑、磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂、脫氧戊糖脫氧戊糖的破壞的破壞、堿基的損傷和脫落堿基的損傷和脫落都是引起都是引起DNADNA斷裂的原因。斷裂的原因。n堿基損傷或糖基破壞可引起堿基損傷或糖基破壞可引起DNADNA雙螺旋局部變性，形雙螺旋局部變性

7、，形成酶敏感性位點，特異的核酸內切酶能識別并切割這成酶敏感性位點，特異的核酸內切酶能識別并切割這樣的部位，造成鏈斷裂。樣的部位，造成鏈斷裂。nDNADNA鏈上被損傷的堿基也可以被另一種特異的鏈上被損傷的堿基也可以被另一種特異的DNA-DNA-糖糖基化酶除去，形成基化酶除去，形成無嘌呤嘧啶位點無嘌呤嘧啶位點（apurinic-apurinic-apyrimidinic site, apyrimidinic site, AP siteAP site），或稱無堿基位點（），或稱無堿基位點（abasic abasic sitesite），這些位點在內切酶等的作用下可形成鏈斷裂。），這些位點在內切酶等的

8、作用下可形成鏈斷裂。nDNA 的共價交聯：的共價交聯：pDNADNA雙螺旋鏈中的一條鏈上的堿基與另一條鏈上的堿雙螺旋鏈中的一條鏈上的堿基與另一條鏈上的堿基以共價鍵結合，稱為基以共價鍵結合，稱為DNADNA鏈間交聯鏈間交聯（DNA DNA interstrand cross-linkinginterstrand cross-linking）。）。pDNADNA分子中同一條鏈中的兩個堿基以共價鍵結合，稱分子中同一條鏈中的兩個堿基以共價鍵結合，稱為為DNADNA鏈內交聯鏈內交聯（DNA intrastrand cross-linkingDNA intrastrand cross-linking）。）

9、。pDNADNA分子還可與蛋白質以共價鍵結合，稱為分子還可與蛋白質以共價鍵結合，稱為DNA-DNA-蛋白蛋白質交聯質交聯（DNA protein cross-linkingDNA protein cross-linking）。）。DNA損傷可導致損傷可導致堿基置換堿基置換缺失缺失 插入插入 鏈的斷裂鏈的斷裂 轉換轉換顛換顛換第二節第二節 DNA損傷的修復損傷的修復The repair of DNA damage DNADNA修復（修復（DNA repairDNA repair）是指糾正）是指糾正DNADNA兩條單鏈兩條單鏈間錯配的堿基、清除間錯配的堿基、清除DNADNA鏈上受損的堿基或糖基鏈上

10、受損的堿基或糖基、恢復、恢復DNADNA的正常結構的過程。的正常結構的過程。 DNADNA修復是機體維持修復是機體維持DNADNA結構的完整性與穩定結構的完整性與穩定性，保證生命延續和物種穩定的重要環節。性，保證生命延續和物種穩定的重要環節。常見的常見的DNA損傷修復途徑損傷修復途徑 修復途徑修復途徑 修復對象修復對象 參與修復的酶或蛋白參與修復的酶或蛋白光復活修復光復活修復 嘧啶二聚體嘧啶二聚體 光復活酶光復活酶堿基切除修復堿基切除修復 受損的堿基受損的堿基 DNADNA糖基化酶、無嘌呤嘧啶核酸內切酶糖基化酶、無嘌呤嘧啶核酸內切酶核苷酸切除修復核苷酸切除修復 嘧啶二聚體、嘧啶二聚體、DNAD

11、NA螺旋結構的改變螺旋結構的改變 大腸桿菌中大腸桿菌中UvrAUvrA、UvrBUvrB、UvrCUvrC和和UvrDUvrD，人人XPXP系列蛋白系列蛋白XPAXPA、XPBXPB、XPCXPGXPCXPG等等錯配修復錯配修復 復制或重組中的堿基復制或重組中的堿基配對錯誤配對錯誤 大腸桿菌中的大腸桿菌中的MutHMutH、MutLMutL、MutSMutS，人的，人的MLH1MLH1、MSH2MSH2、MSH3MSH3、MSH6MSH6等等重組修復重組修復 雙鏈斷裂雙鏈斷裂 RecARecA蛋白、蛋白、KuKu蛋白、蛋白、DNA-PKcsDNA-PKcs、XRCC4XRCC4損傷跨越修復損傷

12、跨越修復 大范圍的損傷或復制大范圍的損傷或復制中來不及修復的損傷中來不及修復的損傷 RecARecA蛋白、蛋白、LexALexA蛋白、其他類型蛋白、其他類型DNADNA聚聚合酶合酶n嘧啶二聚體的直接修復嘧啶二聚體的直接修復一、可以直接修復的一、可以直接修復的DNA損傷損傷嘧啶二聚體；烷基化堿基；無嘌呤位點；單鏈斷裂等嘧啶二聚體；烷基化堿基；無嘌呤位點；單鏈斷裂等n烷基化堿基的直接修復烷基化堿基的直接修復n無嘌呤位點的直接修復無嘌呤位點的直接修復pDNADNA嘌呤插入酶嘌呤插入酶能催化游離嘌呤堿基或脫氧核苷與能催化游離嘌呤堿基或脫氧核苷與DNADNA嘌呤缺如部位重新生成糖苷共價鍵，導致嘌呤堿嘌呤

13、缺如部位重新生成糖苷共價鍵，導致嘌呤堿基的直接插入。具有很強的基的直接插入。具有很強的專一性專一性。n單鏈斷裂的直接修復單鏈斷裂的直接修復pDNADNA連接酶連接酶能夠催化能夠催化DNADNA雙螺旋結構中一條鏈上缺口雙螺旋結構中一條鏈上缺口處的處的5 5 - -磷酸基團與相鄰片段的磷酸基團與相鄰片段的3 3 - -羥基之間形成磷酸二羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而直接參與部分酯鍵，從而直接參與部分DNADNA單鏈斷裂的修復，如電單鏈斷裂的修復，如電離輻射所造成的切口。離輻射所造成的切口。n堿基切除修復堿基切除修復（base excision repair） 識別水解識別水解：DNADNA糖基化酶特

14、異性識別糖基化酶特異性識別DNADNA鏈中已受損的鏈中已受損的堿基并將其水解去除，產生一個無堿基位點；堿基并將其水解去除，產生一個無堿基位點； 切除切除：在此位點的：在此位點的5 5 端，無堿基位點核酸內切酶將端，無堿基位點核酸內切酶將DNADNA鏈鏈的磷酸二酯鍵切開，去除剩余的磷酸核糖部分；的磷酸二酯鍵切開，去除剩余的磷酸核糖部分； 合成合成：DNADNA聚合酶在缺口處以另一條鏈為模板修補合成聚合酶在缺口處以另一條鏈為模板修補合成互補序列；互補序列； 連接連接：由：由DNADNA連接酶將切口重新連接，使連接酶將切口重新連接，使DNADNA恢復正常恢復正常結構結構二、切除修復是最普遍的二、切除

15、修復是最普遍的DNA損傷修復方式損傷修復方式堿基切除修復堿基切除修復 ；核苷酸切除修復；核苷酸切除修復n核苷酸切除修復核苷酸切除修復（nucleotide excision repair） 首先，由一個酶系統識別首先，由一個酶系統識別DNADNA損傷部位；損傷部位； 其次，在損傷兩側切開其次，在損傷兩側切開DNADNA鏈，去除兩個切口之間的鏈，去除兩個切口之間的一段受損的寡核苷酸；一段受損的寡核苷酸； 再次，在再次，在DNADNA聚合酶作用下，以另一條鏈為模板，合聚合酶作用下，以另一條鏈為模板，合成一段新的成一段新的DNADNA，填補缺損區；，填補缺損區； 最后由連接酶連接，完成損傷修復。最后

16、由連接酶連接，完成損傷修復。E.coli的的NER主要由主要由4種種蛋白質組成：蛋白質組成：UvrAUvrBUvrCUvrD n人類的人類的DNA損傷核苷酸切除修復損傷核苷酸切除修復 首先由損傷部位識別蛋白首先由損傷部位識別蛋白XPCXPC和和XPAXPA等，再加上等，再加上DNADNA復制所需的復制所需的SSBSSB，結合在損傷，結合在損傷DNADNA的部位；的部位； XPBXPB、XPDXPD發揮解旋酶的活性，與上述物質共同作用發揮解旋酶的活性，與上述物質共同作用在受損在受損DNADNA周圍形成一個凸起；周圍形成一個凸起； XPGXPG與與XPFXPF發生構象改變，分別在凸起的發生構象改變

17、，分別在凸起的3-3-端和端和5-5-端發揮核酸內切酶活性端發揮核酸內切酶活性, , 在增殖細胞核抗原在增殖細胞核抗原（PCNAPCNA）的幫助下，切除并釋放受損的寡核苷酸；）的幫助下，切除并釋放受損的寡核苷酸； 遺留的缺損區由聚合酶遺留的缺損區由聚合酶 或或 進行修補合成；進行修補合成； 最后，由連接酶完成連接。最后，由連接酶完成連接。NER不僅能夠修復整個基因組中的損傷，而不僅能夠修復整個基因組中的損傷，而且能拯救因轉錄模板鏈損傷而暫停轉錄的且能拯救因轉錄模板鏈損傷而暫停轉錄的RNA聚合聚合酶，即參與酶，即參與轉錄偶聯修復（轉錄偶聯修復（transcription-coupled repa

18、ir）。作用方式：作用方式：NER蛋白質被募集于暫停的蛋白質被募集于暫停的RNA聚合酶。聚合酶。轉錄偶聯修復的意義：轉錄偶聯修復的意義：將修復酶集中于正在轉將修復酶集中于正在轉錄錄DNA，使該區域的損傷盡快得以修復。，使該區域的損傷盡快得以修復。n堿基錯配修復堿基錯配修復（ mismatch repair）錯配是指非錯配是指非Watson-CrickWatson-Crick堿基配對。堿基配對。堿基錯配修復也可被看作是堿基錯配修復也可被看作是堿基切除修復堿基切除修復的一的一種特殊形式，主要負責糾正：種特殊形式，主要負責糾正： 復制與重組中出現的堿基配對錯誤；復制與重組中出現的堿基配對錯誤； 因堿

19、基損傷所致的堿基配對錯誤；因堿基損傷所致的堿基配對錯誤； 堿基插入；堿基插入； 堿基缺失。堿基缺失。 E.coliE.coli錯配修復系統修復復制差錯錯配修復系統修復復制差錯模板鏈模板鏈的的GATC序列甲基化序列甲基化 MutH僅切割僅切割新新合成的合成的DNA鏈鏈 Dam甲基化酶（甲基化酶（methylase）使）使E.coli處于暫時的處于暫時的半半甲基化狀態甲基化狀態，標記母鏈和新合成的，標記母鏈和新合成的DNA鏈，幫助鏈，幫助新合新合成的成的DNA鏈鏈被錯配修復系統識別并修復。被錯配修復系統識別并修復。MutH的切口位于錯配核苷酸的的切口位于錯配核苷酸的5 側側，使用外切酶，使用外切酶

20、或或RecJ，按，按53 方向降解方向降解DNA；切口位于錯配的切口位于錯配的3側側，則使用外切酶，則使用外切酶，按，按3 5 方向降解方向降解DNA。DNA聚合酶聚合酶填補所產生單鏈填補所產生單鏈DNA缺口。缺口。MSH（MutS homologs）蛋白）蛋白與與MutL同源的同源的MLH和和PMS蛋白蛋白真核細胞錯配修復系統無真核細胞錯配修復系統無MutH，也無半甲基化，也無半甲基化標記母鏈。標記母鏈。錯配修復系統利用岡崎片段連接前的錯配修復系統利用岡崎片段連接前的DNA缺口缺口辨別錯配堿基所在的辨別錯配堿基所在的DNA鏈。鏈。真核細胞核苷酸修復錯配系統：真核細胞核苷酸修復錯配系統：切除修

21、復先切除損傷的堿基或核苷酸，然后，重切除修復先切除損傷的堿基或核苷酸，然后，重新合成正常的核苷酸，最后，再經連接酶重新連新合成正常的核苷酸，最后，再經連接酶重新連接，將原來的切口縫合。整個切除修復過程包括接，將原來的切口縫合。整個切除修復過程包括識別、切除、重新合成和重新連接。識別、切除、重新合成和重新連接。切除修復又分為切除修復又分為堿基切除修復堿基切除修復（BER）和）和核苷酸核苷酸切除修復切除修復（NER），兩者的主要差別在于識別損），兩者的主要差別在于識別損傷的機制上，前者是直接識別具體的受損傷的堿傷的機制上，前者是直接識別具體的受損傷的堿基，而后者并不識別具體的損傷，而是識別損傷基，

22、而后者并不識別具體的損傷，而是識別損傷對對DNA雙螺旋結構造成的扭曲。雙螺旋結構造成的扭曲。DNA糖苷酶都糖苷酶都是沿著是沿著DNA小小溝掃描溝掃描DNA，當找到受損傷的當找到受損傷的堿基以后即與堿基以后即與DNA結合，并結合，并導致導致DNA結構結構發生歪曲，以便發生歪曲，以便將損傷的堿基擠將損傷的堿基擠出雙螺旋，進入出雙螺旋，進入它的活性中心被它的活性中心被切割。切割。 真核細胞的堿基切除修復真核細胞的堿基切除修復 NER在所有的生物具有相同的步驟：在所有的生物具有相同的步驟：MMR系統主要用來修復系統主要用來修復DNA分子上錯配堿基對，此外，分子上錯配堿基對，此外，還能修復一些因還能修復

23、一些因“復制打滑復制打滑”而誘發的核苷酸插入或缺失損而誘發的核苷酸插入或缺失損傷。傷。錯配修復系統必須能夠保證只會將子鏈上錯誤的堿基切除，錯配修復系統必須能夠保證只會將子鏈上錯誤的堿基切除，而不會把母鏈中本來就正確的堿基切除。而不會把母鏈中本來就正確的堿基切除。大腸桿菌的大腸桿菌的MMR系統是利用甲基化來區分子鏈和母鏈的系統是利用甲基化來區分子鏈和母鏈的，因此，大腸桿菌內，因此，大腸桿菌內修復復制中產生的錯配堿基的系統又稱為甲基化導向的錯配修復復制中產生的錯配堿基的系統又稱為甲基化導向的錯配修復。真核細胞發現多種與大腸桿菌高度同源的參與錯配修修復。真核細胞發現多種與大腸桿菌高度同源的參與錯配修

24、復的蛋白：復的蛋白：MSH2、MSH6、MSH3等。等。同源重組修復同源重組修復利用細胞內一些促進同源重組的利用細胞內一些促進同源重組的蛋白質來從姊妹染色體或同源染色體那里獲得合適蛋白質來從姊妹染色體或同源染色體那里獲得合適的修復斷裂的信息，這一種方式的精確性較高；的修復斷裂的信息，這一種方式的精確性較高；非同源末端連接（非同源末端連接（NHEJ）修復）修復在無序列同源在無序列同源的情況下，讓斷裂的末端重新連接起來，這種方式的情況下，讓斷裂的末端重新連接起來，這種方式容易發生錯誤，是人類修復雙鏈斷裂的主要方式。容易發生錯誤，是人類修復雙鏈斷裂的主要方式。三、三、DNA嚴重損傷時需要重組修復嚴重損傷時需要重組修復哺乳動物細胞哺乳動物細胞DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接雙鏈斷裂的非同源末端連接 四、某些修復發生在跨越損傷四、某些修復發生在跨越損傷DNA的復制事件之后的復制事件之后 重組跨越損傷修復重組跨越損傷修復 合成跨越損傷修復合成跨越損傷修復大腸桿菌的大腸桿菌的SOS反應反應 大腸桿菌的重組跨越大腸桿菌的重組跨越 一、一、DNA損傷具有雙重效應損傷具有雙重效應 一是給一是給DNADNA帶來永久性的改