1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建與表達(dá)摘要 近年來(lái)，生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的成就促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的蓬勃發(fā)展。用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是生物技術(shù)領(lǐng)域里的又一次革命，它以一個(gè)全新生產(chǎn)珍貴藥用蛋白的模式區(qū)別于傳統(tǒng)藥物的生產(chǎn)。本文著重介紹轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織特異性表達(dá)的最新進(jìn)展。 以合理的費(fèi)用獲取大量在人體內(nèi)原本稀少的血漿蛋白在不久前還只是幻想。然而，近年來(lái)生物學(xué)和分子生物學(xué)取得的顯著進(jìn)展終于使這種幻想成為現(xiàn)實(shí)。其中，將外源DVA用顯微技術(shù)注入生殖細(xì)胞的原核，將重組DVA轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞和將DVA整合入宿主染色體和種系傳遞等重要發(fā)現(xiàn)，使用轉(zhuǎn)基因（Tg）

2、動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白成為可能。此外，生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如對(duì)卵細(xì)胞的獲得、操作以及再植入和重組DNA等技術(shù)進(jìn)步都為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的成功提供了保證。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白一般有兩種技術(shù)路線。第一種是將目的基因在同源組織中表達(dá)蛋白質(zhì)；第二種是將目的基因構(gòu)建成雜合基因，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎，通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分泌器官收集并提純藥用蛋白。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的蛋白經(jīng)過(guò)后加工酷如人體天然蛋白的結(jié)構(gòu)，也有完全相似的生物活性。 同源組織中表達(dá)蛋白質(zhì) 目前，在同源組織中表達(dá)蛋白質(zhì)最典型的例子是在動(dòng)物的紅細(xì)胞中表達(dá)人的血紅蛋白。在人的血紅蛋白基因編碼序列里啟動(dòng)子有2個(gè)CACCC盒，而對(duì)應(yīng)的豬的啟動(dòng)子里只有一個(gè)，另一

3、個(gè)靠近它的是CGCCC盒。Sharma等1將豬的-啟動(dòng)子與人的編碼基因融合，并將人的-基因座調(diào)控區(qū)（-LCR）和、基因與融合基因的基因連接在一起構(gòu)成載體，轉(zhuǎn)入豬胚胎細(xì)胞，從轉(zhuǎn)基因豬分泌乳汁中得到的重組人血紅蛋白含量高達(dá)32g/L。 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分泌器官中生產(chǎn)蛋白 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)重組蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱為靶位。在這些表達(dá)器官中，通過(guò)構(gòu)建合適的載體，選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和調(diào)控序列可產(chǎn)生比正常水平高得多的重組蛋白。不過(guò)，生產(chǎn)系統(tǒng)應(yīng)盡可能與循環(huán)系統(tǒng)隔離，以減少表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主動(dòng)物的影響。 乳腺生物反應(yīng)器 將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需

4、要藥用蛋白。從融合基因轉(zhuǎn)入胚胎細(xì)胞到收集蛋白質(zhì)有一個(gè)過(guò)程，包括胚胎植入、分娩和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個(gè)月；并且只有雌性動(dòng)物泌乳且不連續(xù)，一般可持續(xù)2、6、10個(gè)月。牛、羊等大型家畜能對(duì)藥用蛋白進(jìn)行正確的后加工，使之具有較高的生物活性，同時(shí)產(chǎn)奶量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)，因而成為乳腺生物反應(yīng)器理想的動(dòng)物類型。 抗凝血酶 第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物是抗凝血酶，將半乳糖-酪蛋白的啟動(dòng)子和含抗凝血酶基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白產(chǎn)量可達(dá)7g/L2。目前該蛋白正用于冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)患者的二期臨床驗(yàn)證。 -

5、乳球蛋白 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人們發(fā)現(xiàn)牛的-乳球蛋白（BLG）基因非常穩(wěn)定，并能在乳腺中特異性表達(dá)。Hyttinen等3將含有5端2.8kb和3端1.9kb的牛BLG基因片段構(gòu)建成載體，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺中特異表達(dá)高水平的BLG，此外，還發(fā)現(xiàn)CpG位點(diǎn)的甲基化程度與BLG的表達(dá)量有關(guān)，甲基化少的轉(zhuǎn)基因小鼠乳液中BLG分泌量較大，可達(dá)12mg/ml，而其他轉(zhuǎn)基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。 紅細(xì)胞生成素（EPO） 目前國(guó)內(nèi)外均采用CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)人EPO，成本比較昂貴，而用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的EPO，可能是一條理想的途徑。將EPO dNA分別以Hind和BamHI酶切，1%瓊脂糖凝

6、膠電泳回收5.4kb的Hin/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)載體，再將867bp的BLG啟動(dòng)子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通過(guò)顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠乳汗中的EPO含量可達(dá)0.5g/ml4。 1-抗胰蛋白酶 這也是一個(gè)利用B LG基因構(gòu)建的重組蛋白。將BLG5末端4.0kb序列與人的1-抗胰蛋白酶（1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一個(gè)內(nèi)含子）融合，再連接羊的BLG啟動(dòng)子，以pPOLY-為載體，轉(zhuǎn)入羊的胚胎細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳液中得到含量高達(dá)60.0mg/ml的重組蛋白1AT5。轉(zhuǎn)基因在兩年前進(jìn)入了臨床驗(yàn)證。

7、 因子 Schnieke等6將羊的BLG基因5末端和人的因子 cDNA 與含有BLG復(fù)制單元和3末端的片段融合，將構(gòu)建的雜合基因轉(zhuǎn)入羊的胚胎細(xì)胞，從分泌的乳汁中得到125g/ml的重組蛋白。黃淑幀教授等7構(gòu)建了一個(gè)含有小鼠MAR元件、牛-酪蛋白基因調(diào)控序列和hF微基因的hF乳腺組織特異性表達(dá)載體pMCm，其中hF 微基因包括全長(zhǎng)hF cDNA ，800bp經(jīng)過(guò)改造的內(nèi)含子1序列和hF蛋白的信號(hào)肽序列。將線形化的表達(dá)載體pMC m導(dǎo)入羊的受精卵。轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳汁中hF蛋白的含量約為95ng/ml。在另一實(shí)驗(yàn)中，Yull等8將BLG5末端序列，f編碼序列和缺失隱性3端連接點(diǎn)的f 3末端不翻譯區(qū)域

8、的一個(gè)小片段融合，構(gòu)成雜合基因，去掉SphI和SmaI位點(diǎn)，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞，得到的重組蛋白產(chǎn)量達(dá)0.06mg/ml。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中對(duì)DNA的錯(cuò)誤剪切使分泌量降低，從而增高重組蛋白產(chǎn)率。在乳腺組織中表達(dá)有完全活性的因子是比較成功的，尤其是乳腺組織對(duì)因子 N端附近的一段含12個(gè)葡萄糖殘基的序列進(jìn)行-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)-羧化作用。 因子 人FcDNA長(zhǎng)約7.2kb，是目前為止表達(dá)的最長(zhǎng)cDNA。將它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中啟動(dòng)子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌F重組蛋白。在WA

9、P/FcDNA構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠中rF表達(dá)最低，而在轉(zhuǎn)基因豬中可達(dá)1.02.7g/ml9。 單克降抗體 Castilla等10將編碼了重組單克降抗體（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠基因組的第一個(gè)外顯子，使rMab 6A.C3的表達(dá)可以由WAP基因調(diào)控序列來(lái)控制，將構(gòu)建的雜合基因注入小鼠胚胎細(xì)胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的單克降抗體，這種轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物將廣泛應(yīng)用于預(yù)防新生兒腸道感染。 C蛋白 同樣在WAP基因的第一個(gè)外顯子位點(diǎn)，Drews等11將人C蛋白cDNA插入，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞，可得到產(chǎn)量達(dá)1.6mg/ml的重組蛋白。而將上述雜合基因轉(zhuǎn)入豬的胚胎細(xì)胞，可使豬分泌出380

10、g/mlg/ml·hr的外源蛋白，活性與人血漿中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依賴于輕鏈膜結(jié)合區(qū)域正確的-羧化，因此，轉(zhuǎn)基因豬能分泌有活性的C蛋白表明豬的乳腺細(xì)胞可對(duì)C蛋白前體高速率地進(jìn)行-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。 膀胱生物反應(yīng)器 膀胱反應(yīng)器有著和乳腺反應(yīng)器一樣的優(yōu)點(diǎn)：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不必對(duì)動(dòng)物造成傷害。此外，該系統(tǒng)可從動(dòng)物一出生就收集產(chǎn)物，不論動(dòng)物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器最顯著的優(yōu)勢(shì)在于從尿中提取蛋白質(zhì)比在乳汁中提取簡(jiǎn)便、高效。 膀胱生物反應(yīng)器多用Uroplakin啟動(dòng)子啟動(dòng)人生長(zhǎng)激素（hGH）的表達(dá)，產(chǎn)生 hGH特異性的高豐度RNA，這些R

11、NA與蛋白分泌量高度相關(guān)。Uroplakin基因在多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。 生長(zhǎng)激素 Kerr等12將pUPII-LacI用質(zhì)粒的Kpn i進(jìn)行消化，用T4DNA多聚酶切去3端，然后用BamHI消化，分離出3.6kb的5端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反應(yīng)器特異性表達(dá)所需的大部分序列。將此片段與位于無(wú)啟動(dòng)子的pOGH質(zhì)粒純化SaI和BamHI位點(diǎn)間的hGH結(jié)構(gòu)基因的5端連接，得到pUPII-hGH質(zhì)粒，能表達(dá)該質(zhì)粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質(zhì)粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于顯 微注射，

12、在膀胱上皮細(xì)胞中合成hGH，收集轉(zhuǎn)基因動(dòng)物尿液，從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物會(huì)因hGH的作用逐漸肥胖，并導(dǎo)致雌性動(dòng)物不育癥。乳腺生物反應(yīng)器也能表達(dá)hGH。用同源重組方法將hGH基因?qū)?10kb的人-乳球蛋白位置依賴性YAC載體，將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎，轉(zhuǎn)基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可達(dá)0.258.9mg/ml13。 翻譯與修飾 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的蛋白，特別是糖鏈成分的結(jié)構(gòu)與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應(yīng)器中，蛋白質(zhì)翻譯前修飾的主要方式是在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)乳腺中的蛋白前體進(jìn)行信號(hào)肽剪切和對(duì)糖鏈進(jìn)行修飾。例如，從山羊乳液中得到

13、的長(zhǎng)效組織型纖溶酶原激活劑與人體內(nèi)和相比較，含有少量的異種（外源）低聚糖，同時(shí)，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少，關(guān)且出現(xiàn)缺少蛋白質(zhì)C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，從豬乳液中得到的C蛋白中是沒(méi)有的；從羊乳液中得到的重組1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異；在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶上低聚甘露糖與特異天冬酰胺的位點(diǎn)特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組-干擾素可對(duì)翻譯前修飾有更好的理解，-干擾素有大量的位點(diǎn)特異性變化，在N端連接位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)雜的唾液酸酸化和連接核心巖藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。與從小鼠細(xì)胞中取得的蛋白質(zhì)相比，分泌的重組蛋白沒(méi)有GalNAc、NeuGC和

14、Gall 、3Gal-l、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類型可與細(xì)胞上的受體結(jié)合并清除病人體內(nèi)的重組蛋白，因此可能會(huì)影響療效，最終的結(jié)果尚有待驗(yàn)證。 同源組織表達(dá)蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控并校正珠蛋白鏈的翻譯過(guò)程，避免無(wú)效的翻譯前修飾，使產(chǎn)物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似，降低人體內(nèi)的排斥反應(yīng)，提高藥物蛋白療效。目前，蛋白分離技術(shù)飛速發(fā)展，大大提高了蛋白質(zhì)分離的可行性和分離效率。第二種技術(shù)路線中目前以乳腺生物反應(yīng)器較為多見，因?yàn)槿橹椎玫剑胰橹械奶禺惖鞍缀枯^大，對(duì)蛋白水解酶的降解作用也比較穩(wěn)定。乳汁是一種混合物，含3%6%的總蛋白，3%5%的脂類，對(duì)蛋白提純技術(shù)要求比

15、較高。另一方面，藥用蛋白是在動(dòng)物乳腺中產(chǎn)生。因此只有含轉(zhuǎn)基因型人雌性動(dòng)物在泌乳期才能生產(chǎn)藥用蛋白，可用的動(dòng)物數(shù)目有限，且生產(chǎn)期較短。膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于含有轉(zhuǎn)基因型的兩性動(dòng)物都可用，產(chǎn)后收集時(shí)間長(zhǎng)，提取產(chǎn)物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多，盡管收集的尿液多且時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)單位數(shù)量的藥用蛋白在乳腺和膀胱生物反應(yīng)器中的成本是差不多的 問(wèn)題與展望 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的應(yīng)用中，有些問(wèn)題尚待解決。比如，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因是鑲嵌整合型的，因此它的下一代并不都轉(zhuǎn)基因型。但是在綿羊，豬和山羊中觀察到只要轉(zhuǎn)基因型從起始個(gè)體傳給了下一代，這種轉(zhuǎn)基因型就可以穩(wěn)定地遺傳好幾代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低

16、，胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大大減少。同時(shí)，由于對(duì)調(diào)控表達(dá)水平的程序，指導(dǎo)進(jìn)行精確的組織特異性和發(fā)育調(diào)控表達(dá)的程序，以及調(diào)控和編碼內(nèi)含子序列間可能的相互作用的認(rèn)識(shí)尚不充分14，容易引起異位點(diǎn)表達(dá)；由于現(xiàn)在的技術(shù)還不能控制整合的位點(diǎn)，因此存在對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行插入誘變的可能性，轉(zhuǎn)基因型的表達(dá)會(huì)受整合的不同位點(diǎn)的影響。這些因素使得在家畜長(zhǎng)成前，要用小鼠對(duì)新基因構(gòu)型進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥用蛋白可用于預(yù)防和治療疾病，其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及口服用藥引起的耐受性等問(wèn)題都在作進(jìn)一步研究。以轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，這項(xiàng)生物技術(shù)最終將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。 參考文獻(xiàn) 1S

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