1、實驗指導目 錄實驗一 分子生物學實驗室常用儀器及使用方法實驗二 質粒 DNA 的提取-堿裂解法實驗三 瓊脂糖凝膠電泳實驗四 限制性內切核酸酶的酶切與鑒定實驗五 大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化實驗六 動物組織細胞基因組 DNA 提取實驗七 DNA 的定量實驗八 PCR 基因擴增實驗九 瓊脂糖凝膠電泳分離與純化目的 DNA實驗十 DNA 重組實驗十一 動物組織細胞總 RNA 的提取實驗一 分子生物學實驗室常用儀器及使用事實證明, 在科學飛速發展的今天, 無論從事哪個領域的研究,要想突破,除了有良好的理論基礎外,更重要的是依賴于先進的技術和優良的儀器設備以及良好的研究環境。 一個標準的分子生物學實驗

2、室除了具有一般生物學實驗室的常規儀器設備外, 還具有一些特 殊用途的儀器, 這些儀器一般較精密, 價格昂貴。 下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項。一、冷凍離心機低溫分離技術 是分子生物學研究中必不可少的手段。 基因片段的分離、酶蛋白 的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實驗中都離不開低溫離心技術 , 因此低溫冷凍離 心機成為分子生物學研究中必備的重要儀器。 在國內, 有多個廠家生產冷凍離心機, 本實驗 室的高速冷凍離心機為 GL-20G-型(上海安亭 ,落地式。配有角式轉頭:6×50ml 、 12×10ml 和 12×1.5ml 。極限轉速 20000rpm

3、。1. 安裝與調試離心機應放置在水平堅固的地面上,應至少距離 10cm 以上且具有良好的通風環境 中,周圍空氣應呈中性,且無導電性灰塵、易燃氣體和腐蝕性氣體,環境溫度應在 030 之間,相對濕度小于 80%。試轉前應先打開蓋門,用手盤動轉軸,輕巧靈活,無異?，F象 方可上所用的轉頭。 轉子準確到位后打開電源開關,然后用手按住門開關, 再按運轉鍵,轉 動后立即停止,并觀察轉軸的轉向,若逆時針旋轉即為正確,機器可投入使用。2. 操作程序(1插上電源, 待機指示燈亮; 打開電源開關,調速與定時系統的數碼管顯示的閃爍數 字為機器工作轉速的出廠設定,溫控系統的數碼管顯示此時離心腔的溫度。(2設定機器的工作

4、參數,如工作溫度,運轉時間,工作轉速等。(3將預先平衡好的樣品放置于轉頭樣品架上,關閉機蓋。(4按控制面板的運轉鍵,離心機開始運轉。在預先設定的加速時間內,其運 速升 至預先設定的值。(5 在預先設定的運轉時間內(不包括減速時間 , 離心機開始減速,其轉速在預先設 定的減速時間內降至零。(6按控制面板上的停止鍵,數碼管顯示 dedT ,數秒鐘后即顯示閃爍的轉速值,這時 機器已準備好下一次工作。3. 注意事項(1離心機應始終處于水平位置,外接電源系統的電壓要匹配,并要求有良好的接地 線,機器不使用,要拔掉電源插頭。(2開機前應檢查轉頭安裝是否牢固,機腔中有無異物掉入。(3樣品應預先平衡,使用離心

5、筒離心時離心筒與樣品應同時平衡。(4揮發性或腐蝕性液體離心時,應使用帶蓋的離心管,并確保液體不外漏以 免腐蝕機腔或造成事故。(5除工作溫度、運轉速度和運轉時間外,不要隨意更改機器的工作參數,以免影響機 器性能。轉速設定不得超過最高轉速,以確保機器安全運轉。(6使用中如出現 0.00或其它數字,機器不運轉,應關機斷電, 10秒鐘后重新開機, 待所設轉速顯示后,再按運轉鍵,機器將照常運轉。(7不得在機器運轉過程中或轉子未停穩的情況下打開蓋門,以免發生事故。(8每次操作完畢應做好使用情況記錄,并定期對機器各項性能進行檢修。 二、電泳儀電泳技術是分子生物學研究不可缺少的重要手段。 電泳一般分為自由界面

6、電泳和區 帶電泳大類,自由界面電泳不需支持物, 如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等,這類電 泳目前已很少使用。 區帶電泳需用各種類型的物質作為支持物, 常用的支持物有濾紙、 醋酸 纖維薄膜、 非凝膠性支持物、 凝膠性支持物及硅膠 G 薄層等, 分子生物學實驗中最常用的 是瓊脂糖凝膠電泳。 應用電泳法可以對不同物質進行定性或定量分析, 或將一定混合物進行 組份分析或單個組份提取制備。下面以 DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠 為例介紹其使用方法。1. 使用方法(1按電源開關,顯示屏出現“歡迎使用 DYY-12型電腦三恒多用電泳儀”等字樣后, 同時系統初始化,蜂鳴 4聲,設置常設置

7、。屏幕轉成參數設置狀態,見圖一:U: 0V U =100V |Mode :STDI: 0mA I =50mA |P: 0W P =50W |T: 00:00 T =01:00 |其中 :左側大寫 U: I: P: T: 為電泳時實際值; 中間部分顯示程序的常設值 (預置值 。 Mode(模式 :STD(標準 ; TIME(定時 ; VH (伏時 ; STEP (分步(2設置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如,要求工作電壓 U =1000V ,電流I 限制在 200mA 以內,功率 W 限制在 100W 以內,時間 T 為 3小時 20分,并且到時間自 動關掉輸出。則操作步驟如下:按“模式”

8、鍵,將工作模式由標準(STD 轉為定時(TIME 模 式 。 每 按 一 下 模 式 鍵 , 其 工 作 方 式 按 下 列 順 序 改 變 : STD®TIME®VH®STEP®STD。先設置電壓 U ,按“選擇”鍵,先將其反顯,然后輸入數字鍵即可設置該參數的 數值。按數字 1000, 則電壓即設置完成。設置電流 I ,按“選擇”鍵,先使 I 反顯,然后輸入數字 200。設置功率 P ,按“選擇”鍵,先使 P 反顯,然后輸入數字 100。設置時間 T ,按“選擇”鍵,先使 T 反顯,然后輸入數字 320。如果輸入錯誤,可 以按“清除”鍵,再重新輸入。確

9、認各參數無誤后,按“啟動”鍵,啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態欄中顯 示 Start! 并蜂鳴 4聲, 提醒操作者電泳儀將輸出高電壓, 注意安全。 之后逐漸將輸出電壓加 至設置值。同時在狀態欄中顯示“ Run ” ,并有兩個不斷閃爍的高壓符號,表示端口已有電 壓輸出。在狀態欄最下方,顯示實際的工作時間(精確到秒 。每次啟動輸出時,儀器自動將此時的設置數值存入“ MO ”號存儲單元。以后需 要調用時可以按“讀取”鍵,再按“ 0”鍵,按“確定”鍵,即可將上次設置的工作程序取 出執行。電泳結束,儀器顯示:“ END ” ,并連續蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴。 2. 注意事項(1U、 I 、 P 三個

10、參數的有效輸入范圍是:U :53000V ; I :4400mA ; P :4400W.(2一般情況下,當 No Load !時,首先應關機檢查電極導線與電泳槽之間是否有接觸不良 的地方,可以用萬用表的歐姆檔逐段測量。(3如果輸出端接多個電泳槽,則儀器顯示的電流數值為各槽電流之和,此時應選擇穩壓輸 出,以減小各槽的相互影響。(4注意保持儀器的清潔,不要遮擋儀器后方進風通道。嚴禁將電泳槽放在儀器頂部,避免 緩沖液灑進儀器內部。(5本儀器輸出電壓較高,使用中應不避免接觸輸出回路及電泳槽內部,以免發生危險。(6長期不用儀器,應放置在干燥通風的清潔環境中保存。三、分析天平分析天平是定量分析工作中不可缺

11、少的重要儀器,充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 法,是獲得可靠分析結果的保證。分析天平的種類很多,有普通分析天平、半自動 /全自動 電光分析天平及電子分析天平等。目前實驗室常規備用的是自動化程度較高的電子分析天 平。下面介紹電子分析天平 PL203/01型和 AL104/01型 (METTLER-TOLEDO的性能及使 用方法。 PL203/01型精密電子天平:最大稱量 210g ;實際分度值 0.001g ; AL104/01型高分 辨率電子分析天平:最大稱量 110g ;實際分度值 0.0001g1. 使用方法(1檢查并調整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配(使用配置的穩壓器 ,按 天

12、平儀器要求通電預熱至所需時間 30min 。(2打開天平開關“ on ” , 天平則自動進行靈敏度及零點調節 。待顯示屏上所有字段 短時點亮,天平回零時,可進行正式稱量。(3稱量時將 潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤 上,關上側門,天平將顯示該重量,點擊 “ ®O/T¬”鍵自動校對零,然后逐漸加入待稱物質,直至所需重量為止。(4稱量結束應及時除去稱量瓶(紙 ,關上側門,切斷電源,并做好使用情況登記。 2. 注意事項(1天平應放置在牢固平穩水泥臺或木臺上,室內要求清潔、干燥,同時應避免光線 直接照射到天平上。(2稱量時應從側門取放物質,讀數時應關閉箱門以免空氣流動引起天平擺動。(3

13、揮發性、腐蝕性、強酸強堿類物質應盛于帶蓋稱量瓶內稱量,防止腐蝕天平。(4電子分析天平若長時間不使用,則應定時通電預熱, 每周一次,每次預熱 2h ,以 確保儀器始終處于良好使用狀態。四、分光光度計不同物質對不同波長入射的吸收程度各不相同,從而形成各具特征的吸收光譜 。根據這一 原理, 應用比色法可以對某些有色物質進行定性或定量分析。 但由于比色法僅限于可見光區, 而且精度低, 已遠遠不能滿足高精度微量分析的要求。 隨著科學技術不斷發展, 分析儀器也 不斷地更新換代, 人們引進了分光光度法的概念, 分光光度計隨之應用。 分光光度計由光源、 單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成,它不僅適應于可見

14、光區,同時還擴展至紫外光 區及紅外光區。光密度(OD 是許多溶液中的溶質定量的指標之一,通過所產生的單色光而測定某一溶液對該單色光的吸收值。 分子生物學實驗中常使用紫外分光光度計進行核酸溶 液定量和純度的初步判斷 。下面介紹紫外可見光分光光度計 GeneQantTM Pro(Amersham 的使用方法。 該儀器除了能 檢測核酸樣品濃度外 , 還可進行 蛋白質濃度以及細胞培養液濃度 的測定,能檢測低至幾微升樣品(70µl 和 57µl ,樣品無需稀釋,測量后還可全部回收。使用方法(1打開電源開關(ON ,等待數秒鐘,顯示屏上顯示一系列數據,如本機型號、當前日期 等,這些數據

15、可以重新設置,當出現“ instrument Ready ”即可進入下一程序。(2在儀器面板上有許多功能鍵,其中包括檢測 base sep 、 Tm 、 DNA 、 RNA 、 oligo 、 Protein595assay 、 Protein280 meas、 cell culture等。例如,欲檢測 DNA , 按 DNA 鍵,即進 入 DNA 檢測程序。在顯示屏上:Pathlengh 10mmUnits µg/µl Use 320nm NODilution Faotor 1Insert reference,以上為儀器預設置的參考數據,若按“ enter ”鍵,和“ s

16、elect ”鍵可以將以上的參數進行重 新設定。(3取石英樣品杯 70µl 或 57µl ,容量大小根據需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中,然 后放入儀器上的樣品槽中,放入時注意樣品杯的光學面朝前方。(4按“ set ref ”鍵,進行空白測試。顯示屏上出現一系列數據均“ 0.000”并提示插入樣品 “ Insert sample ” 。將樣品杯取出,吸干水分,稍干燥后,同樣吸入待測樣品,放入樣品槽 中進行測定。(5一個樣品測定完畢,按“ stop ”鍵,返回“ Instrument Ready” 。(6取出樣品杯,吸出樣品,然后用高純水洗幾次,自然晾干。由于樣品杯十分昂貴,

17、使用 時要小心操作。 不能用手指拿樣品杯的光學面,用后要及時洗滌, 可用溫水或稀鹽酸, 乙醇 以至鉻酸洗液(濃酸中浸泡不要超過 15分鐘 ,表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。五、數字式酸度計酸度計是實驗室配置溶液必備的儀器。本實驗室的酸度計為臺式微電腦酸堿度計和 溫度計(Hanna , 測量 pH 范圍為 0.0014.00pH ;溫度為 0.0100.0 ;1. 使用方法(1將 pH 電極和溫度探頭與主機連接,主機與電源連接。(2取出電極保護套, 如果有結晶鹽出現,這是電極常見現象,浸入水后就會消逝。如 果薄膜玻璃或透析膜發干,可在 HI170300電極保存液中浸泡 1小時 。(3 pH

18、校準。 將 pH 電極和溫度探棒浸泡在所選的標準緩沖液內 4cm (建議用 pH6.86、 7.01 , 緩沖液值可通過 “ D ” 或 “ Ñ” 鍵來調節。 按 “ CAL ” 鍵, 儀器將顯示 “ CAL ” 和 “ BUF ” 符號及“ 7.01”數據。當讀數不穩定時,屏幕會顯示“ NOTREADY ” ;當讀數穩定時,屏幕 會顯示“ READY ”和“ CFM ” ,按“ CFM ”鍵確認校準值。 確認第一校準點后 ,將 pH 電極 與溫度探棒浸泡在標準緩沖液內 4cm (建議用 pH4.01、 9.18、 10.01 ;再按“ CAL ”鍵,儀 器將顯示“ CAL ”和“

19、BUF ”符號及“ 4.01”數據。按“ CFM ”鍵確認校正值。(4 pH 測量。校準完畢后,儀器自動進入 pH 測量狀態,將電極與溫度探棒浸泡在待測 溶液約 4cm ,停幾分鐘讓電極讀數穩定 。2. 注意事項(1由于 pH211酸度計內裝有可充電電池,在剛購買或長時間放置后,再使用時,通電 校正測量完畢后,可將電源繼續還插入電源插座,只需關閉開關,這樣可以保證電池充電, 是校正值得以儲存,下次測量時無須校正即可進入精確測量。(2不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數偏差太大(±1pH ,則是由于 沒有校正或電極變干。為避免電極受損,在關機前要將 pH 電極從溶液中拿出。當

20、處于關機 狀態時,在電極浸入電極保存液前,電極要與機器分開。(3 如儀器已測過幾種不同的樣品溶液,請用自來水清洗, 或在插入樣品溶液前,用待測 樣品清洗電極。(4溫度會影響 pH 的讀數,為測量準確的 pH 值, 溫度要在適合的范圍內進行自動溫度 補償,用 HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中, 緊靠電極并停幾分鐘 ,如果被測溶液的溫度已 知或測量是在相同溫度下進行, 只需動手補償, 那么此時溫度探棒是不用連接, 屏幕上會顯 示溫度讀數伴有信號閃爍。溫度可通過“ Ñ”或“ D ”來調節。六、 PCR 儀PCR 儀,也稱 DNA 熱循環儀、基因擴增儀,它是使一對寡核苷酸引物結合到正負

21、DNA 鏈 上的靶序列兩側,從而酶促合成拷貝數為百萬倍的靶序列 DNA 片段,它的每一循環包括在 三種不同溫度進行 DNA 變性、引物復性、 DNA 聚合酶催化的延伸反應的三個過程。PCR 儀主要應用于基礎研究和應用研究等許多領域,如基因分析、序列分析、進化分析、 臨床診斷、法醫學等等。隨著分子生物學的不斷發展, PCR 擴增技術也得到普及推廣應用,因此了解 PCR 儀的性能,熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過程中的注意事項,將是十 分必要的。現介紹 PCR 擴增儀(Tl Thermocycler的使用方法和注意事項。1. 使用方法(1接通電源開關,儀器進入準備狀態;在顯示屏上記錄了當前儀器的

22、溫度和蓋子(Lid 的溫度。 若儀器正在運行時, 須按 “ B ” 鍵 (start/stop , 才能退出運行并返回準備狀態。(2編寫程序段。在準備狀態下按“ C ”鍵 (programs進入編程狀態,選定一程序號,然 后按“ enter ”鍵,進入下一程序;按 “ A ” (list鍵后,選一文件號(empty program ;再按 “ enter ”鍵,進入下一程序;按“ ABC ”鍵,進入下一程序,用上下左右鍵號選擇一個字 母(A 、 B 、 C 、 D 、 ,然后按“ enter ”鍵,進入下一程序;按“ name ok”鍵,完成文件 命名。(3設定蓋子的溫度。 “ lid tem

23、p :” ,蓋子的溫度一般比變性溫度要高 10,例如變 性溫度是 95,那么蓋子的溫度就要設定為 105。待蓋子預熱后按“ enter ”鍵,進入下一 程序。(4設定變性溫度、變性時間、延伸溫度、延伸時間、退火溫度、退火時間及循環總數等參 數。從第一步依次按“ enter ”鍵進入,用四個移位鍵移動設定位置。先設定溫度,后設定時 間,全部參數設置完后,按“ pgm ok”鍵,所設定的程序自動被保存。(5運行程序。檢查設定是否正確, 按“ start ”鍵,選擇設定好的程序,開始運行。顯示 屏上可觀察到系統運行的情況,按“ Stop ”可停止運行。七、凝膠成像系統本系統屬全自動電腦控制影像分析系

24、統,主要拍攝核酸的 agarose 電泳膠片,及蛋白質的 acrylamide 電泳膠片。在與 markers 比較后,可精確計算樣本的分子量,對核酸電泳也可準 確定量,是分子生物學及生化蛋白試驗的重要檢測工具。 本系統包括暗箱, 紫外透射儀,攝 像頭,變焦鏡,電腦以及專業凝膠圖象采集及分析 . 軟件(3.3版 。該軟件提供對電泳凝膠、 斑點測量、 PCR 密度的定量分析等。此外,還提供圖像采集、標注、打印、數據和圖像發 送到 Word 、 Excel 、圖像處理等功能。1. 使用方法(1 打開電腦,啟動凝膠分析軟件,進入用戶界面。(2打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關,放入凝膠,打開紫外光源

25、或白光光源, 將采集裝置與電腦上采集卡相連,然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖 像采集”按鈕,出現圖像窗口:“開始采集” 、 “停止采集” 、 “采集圖像”等。如果圖像不清 晰,可以調節暗箱上的變焦鏡,使之清晰?？芍苯訉D像保存起來,也可通過“圖像處理”對圖像進行旋轉、裁剪、濾波、調節對比度方面的處理。(3對讀入的電泳凝膠圖像,可以啟動電泳凝膠分析系統。在“功能選擇”菜單中選 擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具,將出現泳道分析工具欄,并在“圖像顯 示”子窗口中出現一個紅色的矩形框。還可進入“條帶分析”系統,對條帶 進行編號,對 二條以上的條帶進行比較。(4 采集圖像結

26、束后, 關閉暗箱電源開關, 從暗箱中取出凝膠, 并將玻璃板清洗干凈, 晾干。八、空氣恒溫搖床搖床(振蕩器為實驗室的常規設備。 SHK-99-型臺式空氣恒溫搖床,采用微電腦控制系 統, 溫度范圍:室溫+560,精度±0.5;時間范圍:1分鐘99小時 59分鐘;轉 速范圍:60RPM 250RPM 。1. 使用方法(1 LED 屏幕上各段數據:RPM Temp Time1 000 00.0 00:00屏幕上“ 1”表示第一段,如果是第二段則為“ 2” , “ Temp ”表示溫度, “ RPM ”表示每分鐘 轉速, “ Time ”表示時間,不設定時可自動累計時間一直運行。 “ Temp

27、 ” 、 “ RPM ” 、 “ Time ” 的值隨時可以修改,隨時按新值運行。(2工作程序設置。按“ F1”鍵,進入設置狀態?？稍谒俣?溫度,時間,運行等四部分之 間切換。在每一部分按“ F2”鍵輸入數據,輸入完十位數據,再輸入個位數據,按“ F2” 鍵,再按“ F2”鍵,到小數位,再按“ F2”鍵,又到十位,以此循環。(3再按“ F1”鍵,轉回運行狀態,按“ Start ”鍵,電機開始運行,時間開始計時。(4按“ End ”鍵,結束系統運行。2. 注意事項(1打開電源,系統開始自檢,等待 LCD 屏幕出現“ WELCOME ”字樣,系統自檢 完畢,可以進行第 2步參數設置。若屏幕出現:a

28、. “ TEMP ERROR ” ,表示溫度檢測線路有 錯誤; b. “ MOTOR ERROR” ,表示電機部分有錯誤。(2運行過程可以打開箱蓋,這樣電機不運行,時間也停止,蓋上蓋接著運行。(3工作完畢,關閉電源。關機后,要等一段時間再開機。九、水的凈化裝置分子生物學實驗對水的純度要求越來越高, 一般蒸餾水常常難以滿足實驗要求, 大多要求要 進行第二次蒸餾(雙蒸水 ,它可以去除水中的大部分有機雜質,但制作時間較長,而且無 機雜質還是很多。許多實驗還需要去離子水,這就需要陰陽離子交換樹脂進行處理。目前, 分子生物學實驗室都使用高質量的超純水。如美國微孔濾膜公司的 Milli-Q 超純水制造系統

29、 所制造的超純水適用于許多學科領域,如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、 DNA 測 序、酶反應、組織和細胞培養等實驗。下面介紹 RO-MB 壁掛式反滲透高純水機性能及使用 方法。 RO-MB 反滲透高純水機(杭州永潔達產水量(25 10L/H;產水水質:RO 純水: <10s/cm,高純水:>15M.cm ;可用自來水制成普通實驗用水和高純水,同時滿足不同 水質要求。在線電導率儀對產水水質連續檢測,可保證產水質量。1. 使用方法(1準備:先檢測與純水機相連的原水管路、廢水管路連接是否正常,打開原水閥門。供電 電源是否正常,檢查按鈕是否在關閉狀態(按鈕彈出狀態 。將電源插頭插入帶

30、有接地線的 220V 電源插座上。(2開機:依次按下電源開關,泵開關,純水機啟動產水,同時廢水排出,指示燈亮起,并 處于自動運行狀態。(3取純水:若打開 RO 純水或高純水出口閥門,則可獲得相應水質的純水。當高純水出口 閥門打開時, 檢測儀表顯示高純水電導率或電阻值。 為了獲得高質量的高純水, 可以先放掉 一杯水后再取新鮮水。(4關機:不用時可關閉個按鈕停機,自來水進水閥門不必關閉,這時機子內部的進水電磁 閥已自動切斷水路。只要管路閥門不漏,也可使機子保持自動待機狀態。2. 注意事項(1純水機的正常使用環境溫度為 1535,產水量會隨溫度降低而下降,冬季保養溫 度不低于 5。(2 預處理濾芯一

31、般三至六個月更換一次,實際使用壽命與自來水水質、總過濾量等有 關。(3 混床濾芯產高純水約 13噸, 約二至四個月更換一次, 實際使用壽命與自來水水質、 水中含鹽量、總用水量等有關。 設備停運時間超過 2天。 必須注意定期沖洗維護。夏季宜每 天開機 30分鐘沖洗一次,冬季每隔 23天開機沖洗一次。(4使用過程若發現停機后泵仍頻繁地每隔數分鐘有規則地啟動數秒鐘又停機,此為管 路漏水引起, 需及時打開機箱加以解決。 若每隔半小時以上啟動數秒鐘又停機, 乃屬正?，F象, 有利于沖洗和保護反滲透膜元件, 避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積, 尤其高溫季節。 十、消毒設備細菌和細胞培養以及核酸等有關實驗所用

32、的試劑、 器皿及實驗用具, 應嚴格滅菌, 有的實驗 還要求沒有核酸酶的污染,故應將實驗器械,試劑等進行高壓消毒。對于經過導入 DNA 重 組分子的菌株,操作后必須進行嚴格的高壓消毒滅活處理。大批實驗物品、 試劑、培養基等可以使用大型消毒器進行消毒。一些不能經受高壓、高溫消 毒的試劑可用濾器濾膜除菌,器皿可用紫外線照射、 75%乙醇或 0.1%的十二烷基硫酸鈉 (SDS 浸泡消毒。所有的細胞培養、細菌培養的操作,都應在紫外線消毒后的超凈工作臺 中進行。下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40BI 的使用方法。1. 使用方法(1開蓋:轉動手輪,使鍋蓋離開密封圈。(2通電:連接自動進水裝置。接

33、通電源,將控制面板上電源開關按至 ON 處,若水位 低(LOW 紅燈亮,蒸發鍋內屬斷水狀態;缺水(LACK 黃燈亮,電源已正常輸入。(3加水:打開水源,水位達到低水位,控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅,加 熱(1-綠燈亮,繼續加水至高水位(HIGH 綠燈亮,自動停止加水。(4堆放物品:需包扎的滅菌物品,體積不超過 200mm ×100mm ×100mm 為宜,各 包裝之間留有間隙,堆放在金屬框內,這樣有利于蒸汽的穿透,提高滅菌效果。(5密封高壓鍋:推橫梁入立柱內,旋轉手輪,使鍋蓋下壓,充分壓緊。(6設定溫度:通電后數顯窗燈亮,上層為紅色,顯示溫度,下層為綠色,設定溫度

34、和時間。先按控制面板上確認鍵,綠色數顯閃爍,進入溫度設定狀態。按一次移位鍵 所 指相應位置閃爍,根據所需數據位置進行(單項循環移位。按增加鍵或 ? 減少鍵,進行 所需溫度設定。設定完畢,按二次確認鍵,進行溫度確認。(7設定時間:按一次確認鍵,將溫度設定切換成時間設定;再按一次移位鍵,所指 相應位置閃爍, 根據所需數據位置進行移位; 按增加鍵或減少鍵, 進行所需時間設定。 設定 完畢, 按二次確認鍵, 進行時間設定確認。 時間采用倒計時, 當滅菌鍋內溫度達到設定溫度, 定時器開始倒計時。(8滅菌:在加熱初,將下排汽閥打開至垂直位置;下排汽閥待蒸汽冒出時,壓力表 顯示指示為 100時,將下排汽閥推

35、向水平關閉位置;留有微量蒸汽逸出,以控制總汽流量 的 15%為宜。 使用最高滅菌溫度為 124126, 壓力在 0.145Mpa 0.165Mpa 范圍內屬于 安全閥設定數,超出壓力部分,安全閥將自動泄壓,并開始計數滅菌所需時間。滅菌完成,電控裝置將自動關閉加熱系統,伴有蜂鳴提醒;并將保溫時間切換成 END 顯示;此時,將 控制面板上電源開關按至 OFF 處;關閉電源,停止加熱待其冷卻。(9干燥:物品滅菌后需要迅速干燥,須打開放汽閥和下排汽閥,將滅菌器內的蒸汽迅 速排出,使物品上殘留水蒸汽快速揮發。(10將蓋開啟,取出已滅菌物品。關閉水源,打開下排水閥,排盡滅菌室的水與水垢, 以備下次使用。2

36、. 注意事項(1堆放滅菌物品時,嚴禁堵塞安全閥的出汽孔,必須留出空位保證其空氣暢通,否則 安全閥因出汽孔堵塞不能工作,造成事故。(2滅菌液體時,應將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中,以不超過 3/4體積為好,瓶口 選用棉花紗塞, 切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞, 特別注意, 在滅菌液體結束時不準立即釋 放蒸汽,必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。(3對不同類型,不同滅菌物要求的物品,切勿放在一起滅菌,以免顧此失彼,造成損 失。實驗二 質粒 DNA 的提取-堿裂解法一、實驗原理細菌質粒是一類雙鏈、閉環的 DNA ,大小范圍從 1kb 至 200kb 以上不等。各種質粒都是存 在于細胞質中、 獨立于細胞

37、染色體之外的自主復制的遺傳成份, 通常情況下可持續穩定地處 于染色體外的游離狀態, 但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上, 隨著染色體的復 制而復制,并通過細胞分裂傳遞到后代。一般分離質粒 DNA 的方法都包括 3個步驟:培養細菌,使質粒 DNA 大量擴增;收集 和裂解細菌;分離和純化質粒 DNA 。分離制備質粒 DNA 的方法很多,其中常用的方法 有堿裂解法、煮沸法、 SDS 法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據宿主菌株類 型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒 DNA 的用途進行選擇。本實驗介紹堿 裂解法提取質粒 DNA 。堿裂解法提取質粒 DNA 是根據共價閉合環狀

38、質粒 DNA 和線性染色體 DNA 在拓撲學上的差 異來分離質粒 DNA 。在 pH 值介于 12.0-12.5這個狹窄的范圍內,線性的 DNA 雙螺旋結構 解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒 DNA 的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈 彼此相互盤繞, 仍會緊密地結合在一起。 當加入 pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復 pH 至中性時, 因為共價閉合環狀的質粒 DNA 的兩條互補鏈仍保持在一起,因此復性迅速而準確,而線性 的染色體 DNA 的兩條互補鏈彼此已完全分開,復性就不會那么迅速而準確,它們相互纏繞 形成不溶性網狀結構,而復性的質粒 DNA 恢復原來構型,保持可溶性狀態。通過離心,染

39、色體 DNA 與不穩定的大分子 RNA ,蛋白質 -SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去,最后用 酚氯仿抽提純化上清液中的質粒 DNA 。二、儀器及試劑1. 儀器及耗材:37恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、 50 ml離心管、 1.5 ml離心管管、槍頭、各種規格的量筒、接種環、試劑瓶、 100 l或者 250 ml三角瓶、玻 棒等。2. 試劑及配制:LB 培養液的配制:酵母浸提物 5.0 g;胰蛋白胨 10.0 g;NaCl 10.0 g;依次稱量后加入 800 ml去離子水后攪拌至完全溶解,用 5 mol/L NaOH(約 0.2 ml調節培 養液的 pH 值至 7.0。再加

40、去離子水將溶液定容至總體積為 1000 ml, 10磅高壓滅菌 20 min, 冷卻后 4保存。溶液 (GET 緩沖液 :25 mmol/LTris-HCl(pH8.0 , 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖配制:1000 ml1 mol/L Tris-HCl(pH8.0 25 ml0.5 mol/L EDTA(pH8.0 20 ml20% Glucose(1.11mol/L 45 mldH2O910ml將以上溶液混合裝瓶, 10磅高壓滅菌 20 min,冷卻后 4保存。溶液 II (變性液 :200 mmol/L NaOH , 1% SDS配制:500 ml10% S

41、DS 50 ml2N NaOH 50 ml取以上溶液,用滅菌去離子水定容至 500 ml ,充分混勻。室溫保存,此溶液保存時間最好 不超過一個月,最好現用現配。注意:SDS 易產生氣泡,不要劇烈攪拌。溶液 III (醋酸鉀液 :3 mol/L 醋酸鉀(KAc 緩沖液, pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸配制:500 ml醋酸鉀 147 g冰醋酸 57.5 ml加入 300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后,再加去離子水將溶液定容至 500 ml。 高溫高壓滅菌后, 4保存。10×TE 緩沖液(pH 8.0 :100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L ED

42、TA配制:1000ml1 mol/LTris-HCl 緩沖液 (pH 8.0 100ml500 mmol/L EDTA (pH8.0 20 ml加入約 800 ml的去離子水,均勻混合。溶液定容至 1 L。高溫高壓滅菌后, 4保存。苯酚 /氯仿 /異戊醇 (25 : 24 : 1:將量取 25 ml Tris-HCl(pH8.0平衡苯酚,加入 24 ml 氯仿 和 1 ml 異戊醇,充分混合后,移入棕色玻璃瓶中, 4保存。其它試劑:TE (pH8.0 、異丙醇、氯仿 /異戊醇(24:1 、無水乙醇、 70%乙醇、氨卞青霉素 貯存液(50 mg/ml三、操作步驟1. 菌體的培養和收獲(1將 51

43、0 ml 含有氨卞青霉素(AP 的 LB 培養基加入到容量為 100ml 的三角瓶中,然 后接入一單菌落,并保持通氣良好,于 37 220 rpm 振搖過夜培養(約 16h 后可以再轉 接一次,于 37 220 rpm振搖培養 34 h。(2 吸取培養的菌液 1.5 ml, 轉入 1.5 ml的離心管中, 用臺式離心機以 12000 rpm離心 3 min。 棄上清,將離心管倒置,使液體盡可能流盡。2. 質粒 DNA 提取(堿裂解法(1加 100 ul 溶液 重懸細菌沉淀,用槍吹打直至混和均勻。(2 加 200 ul溶液 , 蓋緊管口, 輕緩上下顛倒離心管以混合內容物。 室溫靜置 5 min(

44、溶 液變透明,粘稠 。(3加 150 ul溶液 ,輕微振蕩混和 10 sec,置冰上 10 min (溶液出現白色沉淀 。(4 12000 rpm離心 6 min,取上清液至另一離心管(棄沉淀 。(5加等量的酚 /氯仿 /異戊醇,旋渦混勻 1 min , 12000 r/min離心 6min ,取上清液至另一 離心管。(6加 1倍異丙醇,振蕩混勻,靜置 10 min, 12000 rpm離心 6 min。棄上清液,將離心管 倒置于吸水紙,將附于管壁的殘余液滴除凈。(7加 200 ul 70%乙醇洗滌沉淀物,臺式離心機 12000 rpm離心 2 min,棄上清液,將沉淀 在室溫下晾干(或在 5

45、0-60的烘箱中也可 。(8沉淀加 20l TE, 反復吹打使質粒 DNA 充分溶解,-20保存。四、常見問題及可能原因1. 提取的質粒 DNA 不純:變性不充分;關鍵步驟反應時間過短;離心時間或速度不夠。2. 提取的質粒 DNA 呈涂布狀:操作過程中用力過猛,動作過大;操作系統內有污染。3. 與染色體 DNA 分離不全:變性過程不完全;試劑配制有問題(成分,濃度或 pH 。實驗三 瓊脂糖凝膠電泳一、實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化 DNA 片段的常用技術。把 DNA 樣品加入到一塊包含電解質 的多孔支持介質(瓊脂糖凝膠的樣品孔中,并置于靜電場上。由于 DNA 分子的雙螺旋骨 架兩側帶有含負

46、電荷的磷酸根殘基, 因此在電場中向正極移動。 在一定的電場強度下, DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應。 具有不同的相對分子質量的 DNA 片段泳動速度不一樣, 因而可依據 DNA 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質量的 DNA , 也 可以分離相對分子質量相同,而構型不同的 DNA 分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或 相對分子質量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。 相對分子質量標準參照物相對可 以提供一個用于確定 DNA 片段大小的標準。 在凝膠中加入少量溴化乙錠 (ethidium bromide, EB ,其分子可插入 DNA 的堿基之間,形成一種絡合物,在

47、254365nm 波長紫外光照射 下,呈桔紅色熒光,因此也可對分離的 DNA 進行檢測。一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在 0.2kb 50kb 范圍內的 DNA 片段。本實驗介紹瓊脂糖凝 膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在 DNA 片段分離中的應用方法。二、儀器及試劑1. 儀器及耗材:水平電泳槽、 電泳儀、 凝膠成像分析系統、 微波爐、 微量移液器、 透明膠帶、 點樣板或 parafilm 、 100 ml或 250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。2. 試劑及配制:50×TAE 緩沖液的配制:2 mol/L Tris-乙酸, 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0配制 1000 mlTri

48、s 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入 600 ml去離子水后攪拌溶解,將溶液定容至 1 L后。高溫高壓滅菌,室溫保存。 1×TAE 緩沖液的配制:稱量 20 ml的 50×TAE 緩沖液,再加入 980 ml的去離子水。溴化乙啶貯存液:10 mg/ml 溴化乙啶配制:100 ml稱取 1 g 溴化乙啶,置于 100 ml 燒杯中,加入 80 ml 去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至 100 ml后,轉移到棕色瓶中。室溫保存。6×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍, 0.25%二甲苯青 FF , 30%甘油。配制:10 ml溴酚

49、藍 25 mg二甲苯青 FF 25 mg甘油 3 ml用 6×TAE 緩沖液定溶至 10 ml,分裝成 1 ml/管。 -20保存。其它試劑:DNA 樣品、 DNA Ladder 、瓊脂糖、三、操作步驟1. 制備 1%瓊脂糖凝膠 (大膠用 70ml ,小膠用 50ml :稱取 0.7 g(0.5 g瓊脂糖置于錐形瓶 中, 加入 70 ml(50ml 1×TAE , 瓶口倒扣小燒杯。 微波爐加熱煮沸 3次至瓊脂糖全部融化, 搖勻,即成 1.0%瓊脂糖凝膠液。2. 膠板制備:取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽洗干凈、晾干,放入制膠玻璃板。取 透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好,

50、形成模子。 將內槽置于水平位置, 并在固定位置放 好梳子。將冷卻到 65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上,使膠液緩慢展 開,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。 室溫下靜置直至凝膠完全凝固,垂直輕拔梳子,取 下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加 1×TAE 電泳緩沖液至沒過膠板為止。3. 加樣:在點樣板或 parafilm 上混合 DNA 樣品和上樣緩沖液, 上樣緩沖液的最終稀釋倍數 應不小于 1X 。 用 10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內, 每加完一個樣品, 應 更換一個加樣頭,以防污染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。 (注意:加樣前要先記下 加樣的順

51、序 。4. 電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳,電壓 60-100V ,樣品由負極(黑色向正極 (紅色方向移動。 電壓升高, 瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。 當溴酚藍移動到距離膠板 下沿約 1cm 處時,停止電泳。(5電泳完畢后,取出凝膠,用含有 0.5 ug/ml的溴化乙錠 1×TAE 溶液染色約 20 min ,再 用清水漂洗 10 min。(6觀察照相:在紫外燈下觀察, DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統拍照 保存。四、常見問題及注意事項1.配瓊脂糖時應使其完全熔化后方可制膠。2.瓊脂糖凝膠易于破碎,操作時要輕緩。3.電泳時應注意電源線路,預防觸電。4.溴化乙

52、淀具有致癌作用,配制及使用時應帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室 內使用。5.紫外線對人體有損傷作用,開燈時間不宜太長,注意防護。6. DNA 帶形狀模糊:DNA 加樣過多;電壓太高;凝膠中有氣泡。7.質粒 DNA 的存在形式有 3種,共價閉環 DNA (cccDNA ,常以超螺旋形式存在; 開環 DNA (ocDNA ,此種質粒 DNA 的兩條鏈中有一條發生一處或多處斷裂,因此可以自 由旋轉從而消除張力,形成松弛的環狀分子;線狀 DNA ,因質粒 DNA 的兩條鏈在同一 處斷裂而造成。因此質粒 DNA 電泳的結果中有可能出現三條泳帶,它們的泳動速度為: cccDNA > 線狀 D

53、NA > ocDNA。實驗四 限制性內切核酸酶的酶切與鑒定一、實驗原理限制性內切酶是一類能識別雙鏈 DNA 分子中特異核苷酸序列的 DNA 水解酶, 主 要存在于原核生物中。 根據限制酶的識別切割特性、 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 、型三大類。 其中類酶在分子克隆和基因操作中最為有用,是常用的分子生物學 工具酶。限制性內切酶識別序列長度一般為 48個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下,識別 序列越長,在同一 DNA 分子中識別位點出現的頻率就越小。許多限制性內切酶的酶切位點 已被確定。例如 EcoRl 酶的識別與切割序列為以下 6個堿基對。5 GAATTC 33 CTT AAG

54、 5EcoR I以獨特的方式識別并裂解這個順序,形成兩個 5突出末端:和G AATTCCTT AA G這些末端為互補的,即粘性末端,并可在連接酶的催化下與由 EcoR I 產生的其它分子末端 相連接。限制性內切酶主要用于基因組 DNA 的片段化、重組 DNA 分子的構建與鑒定、載體中目的 基因片段的分離與回收以及 DNA 分子物理圖譜的構建等。根據酶切目的和要求不同,可有 單酶切、 雙酶切或部分酶切等不同方式。 根據酶切反應的體積不同, 可分為小量酶切反應和 大量的酶切反應。小量酶切反應主要應用于質粒的酶切鑒定, 體積為 20 l, 含 0.21 g DNA ,大量酶切反應用于制備目的基因片段

55、,體積為 50100 l , DNA 用量在 1030ug 。本實驗為 EcoR I 對質粒 pUC18的小量酶切。 在質粒的雙鏈環狀 DNA 分子上有多個限制 性內切核酸酶酶切位點。 在用特定的限制性內切核酸酶對質粒進行酶切反應后, 通?？刹捎?瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定酶切效果。二、儀器與試劑1. 儀器:水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設備等。2. 試劑:質粒 pUC18、 EcoR I限制性內切核酸酶、內切酶反應緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、 6×上 樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。三、操作步驟1.限制性內切酶反應一般在滅菌的 0.2或 0.5ml PCR薄壁離心管中進行。2.

56、 酶切反應體系(10ul :酶解緩沖液(10×buffer 1 ul限制性內切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U底物 DNA (質粒 x ul(依質粒濃度而定滅菌 ddH2O 加至 10 ul限制性內切酶最后加入,手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸,混勻后 6000 r/min, 離心 15s 。 37水浴消化 2h 。3. 酶切完畢, 取 5ul 酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳, 鑒定酶切反應效果, 必須用 DNA 分子量標準物同時進行電泳以確定 DNA 片段的大小。 如果酶切不完全, 可繼續 . 酶解消化反 應,或加入適量酶后繼續反應。5. 經電泳觀察酶切反應完全后,將上述反應液置

57、65水浴中 1015min ,中止酶切反應, 將剩余酶切產物保存于 ?C20備用。四、注意事項1. 限制性內切酶需保存于 -20,操作時應將酶保持在冰浴中,避免長時間置于高溫中。2. 限制性內切酶溶液通常含有 50%甘油,加入反應管后,因密度較大,往往沉淀至 溶液底部,所以要充分搖勻。3. 加樣時吸頭垂直進入試劑管,避免碰到管壁,每加完一樣要換一個吸頭,同時在 已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加,避免污染。4. 酶(置于冰盒上應最后加入,盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過 深。5. 酶解消化反應溫度及時間根據該酶使用說明書而定。6. 注意酶的用量,加入的酶量按 1-3U/ug DNA

58、計算,酶的體積應低于反應總體積的 10%,以避免酶液中甘油干擾反應 。酶量過大( 25U/ug DNA時,有產生所謂星號 活性的可能,即在識別序列以外的位點進行切割。此外,反應體系中甘油的質量分數大于 12%,以及缺少 NACL 和存在 M 等情況下,都有可能出現星號活性。五、相關問題1. 酶的保存不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中,這種特定配方的緩沖液能使酶活 性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下:Tris-HCl (7.4 7.8 :維持穩定的 pH 范圍。50-100mmol/L NaCl 或 KCl :提供一定的離子強度。0.1mmol/L EDTA :絡合掉能激活限制酶的鎂離子。 1mmol/L DTT :保護酶分子上的還原性基團。200-500ug/ml BSA:牛血清白