1、分子醫學技能分子醫學技能- -實驗二實驗二n核酸檢測：瓊脂糖凝膠電泳法核酸檢測：瓊脂糖凝膠電泳法PCRKary MullisKary Mullisl PCR技術最早由美國技術最早由美國 Cetus公司人公司人類遺傳研究室類遺傳研究室Kary Mullis及同事于及同事于1985年發現并研制成功的。年發現并研制成功的。l Kary Mullis因發明了因發明了“聚合酶鏈式聚合酶鏈式反應反應”而獲得而獲得1993年度諾貝爾化學年度諾貝爾化學獎。獎。 平臺效應及其原因平臺效應及其原因 染色體多態現象染色體多態現象 蛋白質多態現象蛋白質多態現象 DNA多態現象多態現象n單個核苷酸的點突變即核苷酸的替換

2、單個核苷酸的點突變即核苷酸的替換n單一單一DNADNA序列的插入或缺失序列的插入或缺失n整串整串DNADNA序列的插入或缺失序列的插入或缺失n基因轉換基因轉換w RFLP(restricted fragment length polymorphism)w RAPD(random amplified polymorphic DNA)w 微衛星多態性微衛星多態性(microsatellite polymorphism)w SSCP(single strand conformation polymorphism)w DSCP(double strand conformation polymorphi

3、sm)w DNA芯片芯片(DNA chips)w DNA指紋指紋隨機擴增多態性隨機擴增多態性DNA標記標記(RAPD) 由由Williams等于等于1990年創立。其基本原理與年創立。其基本原理與PCR技術一技術一致；由人工隨機合成的致；由人工隨機合成的DNA 分子為引物，以基因組分子為引物，以基因組DNA 為模板，進行多態性為模板，進行多態性DNA片段的隨機合成。對擴增產物進片段的隨機合成。對擴增產物進行電泳、染色分析，就可直接在紫外光線下看到新合成的行電泳、染色分析，就可直接在紫外光線下看到新合成的DNA分子片段形成的不同條帶。分子片段形成的不同條帶。 遺傳材料的基因組遺傳材料的基因組DN

4、A如果在特定引物結合區域發生如果在特定引物結合區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導致引物結合片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導致引物結合位點的分布發生相應的變化，導致位點的分布發生相應的變化，導致PCR產物增加、缺少或產物增加、缺少或發生分子量變化。若發生分子量變化。若PCR產物增加或缺少，則產生產物增加或缺少，則產生RAPD標記。標記。 不同品種雞基因組的不同品種雞基因組的RAPD分析圖分析圖關于關于apoB基因基因n獨立于獨立于2號染色體短臂末端，編碼號染色體短臂末端，編碼apoB蛋白蛋白質質n全長全長43kb(28個內含子，個內含子，29個外顯子）個外顯子）napoB基因

5、基因DNA多態性或遺傳變異多態性或遺傳變異 高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、 心梗、冠心病、肥胖心梗、冠心病、肥胖napoB基因只要有微小變異（缺陷）都可基因只要有微小變異（缺陷）都可以引起高膽固醇和高甘油三酯血癥以引起高膽固醇和高甘油三酯血癥實驗操作實驗操作 實驗分組，認清試劑（每實驗分組，認清試劑（每2人一小組，一人做乙肝病毒人一小組，一人做乙肝病毒PCR） 一人做一人做apoB) 患者血清患者血清40 l + 40 l DNA 提取液提取液，混勻（，混勻（2大組做一份）大組做一份） 沸水浴沸水浴10min，10000rpm5min（離心機的使用）（離心機的使用）

6、取上清取上清2 l（或（或陽性血清陽性血清2 l）加入一加入一PCR反應管反應管 6000rpm10s，混勻，混勻 PCR儀上，儀上，933min 預變性預變性 (Hema PCR儀的使用與程序設計儀的使用與程序設計) 9345s，5535s，7260s，重復，重復30個循環個循環 72保溫保溫5min，-20保存備用保存備用apoB (用個人基因組用個人基因組DNA為模板）為模板）2*混合液混合液12.5 l引物引物2lDNA模板模板4 l蒸餾水蒸餾水6.5l總體積：總體積：25 l 94 5min（預變性）（預變性） 94 1min（變性）（變性） 60 4min退火退火+延伸（延伸（30

7、個循環）個循環） 60 5min（續延伸）（續延伸） 4 保存保存 PCR加樣表加樣表PCR程序程序瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳n瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶啶(Ethidium bromide, EB)染色染色,在紫外光下至在紫外光下至少可以檢出少可以檢出1-10ng的的DNA條帶條帶,從而可以確定從而可以

8、確定DNA片段在凝膠中的位置。此外片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電還可以從電泳后的凝膠中回收特定的泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶條帶,用于以后用于以后的克隆操作。的克隆操作。 原理：原理：n在在 pH 值為值為 8.08.3 時，核酸分子堿基幾乎不時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差異，

9、從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如核酸分子中嵌入熒光染料（如 EB ）后，在紫）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 瓊脂糖電泳分離瓊脂糖電泳分離DNA的范圍的范圍n瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝膠分離膠分離DNA片度大小范圍較廣片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從分離長度從200bp至近至近50kb的的DNA片段。瓊脂糖通常片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。用水平裝置

10、在強度和方向恒定的電場下電泳。電泳指示劑電泳指示劑 核酸電泳常用的指示劑有兩種，核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（溴酚藍（ bromophenol blue, Bb ）呈藍紫色；二甲苯晴）呈藍紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈藍）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢。溴酚藍慢。 膠濃膠濃（%）溴酚藍溴酚藍二甲苯二甲苯青青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb影響凝膠電泳的因素影響凝膠電泳的因素n DNA的分子大小、構象的分子大小、構象 線狀雙鏈線狀雙鏈DNA分子在一

11、定濃度瓊脂糖凝膠中分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與的遷移速率與DNA分子量對數成反比。分子量對數成反比。 超螺旋超螺旋DNA移動最快移動最快,開環其次、線狀雙鏈開環其次、線狀雙鏈DNA移動最慢。移動最慢。n瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度一個給定大小的線狀一個給定大小的線狀DNA分子分子,其遷移速度在其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分子的大小。影響凝膠電泳的因素影響凝膠電泳的因素n電源電壓電源電壓 在低電壓時在低電壓時

12、,線狀線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。片段的遷移速率與所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于于2kb的的DNA片段的分辨率達到最大片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過所加電壓不得超過5v/cm。 n嵌入染料的存在嵌入染料的存在 熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強使其剛性更強,還會使線狀還會使線狀DNA遷移率降低遷移率降低15。 n離

13、子強度影響離子強度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。的電泳遷移率。在沒有離子存在時在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最電導率最小小,DNA幾乎不移動幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中在高離子強度的緩沖液中(如誤加如誤加10電泳緩沖液電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔嚴重時會引起凝膠熔化或化或DNA變性。變性。 瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、1.5%倒膠倒膠3mm、凝固后拔梳，乙肝、凝固后拔梳，乙肝2板，板，apoB 3板）板）倒緩沖液，倒緩沖液，加樣加樣（樣品（樣品 15ul，Maker 10ul）電泳（方向、電壓電泳（方向、電壓(100V）、時間乙肝）、時間乙肝0.5h,apoB 1h）染色與檢測（替代染料無需另外染色，染色與檢測（替代染料無需另外染色，紫外檢測）紫外檢測）注意事項注意事項n倒膠時把握好膠的溫度，不要高于倒膠時把握好膠的