1、目錄目錄基因重組與基因工程基因重組與基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering第十四章第十四章The biochemistry and molecular biology department of BMUKong lijun QQ359452074目錄目錄DNA克隆、測序與重組技術的歷史克隆、測序與重組技術的歷史 1973年，年，Stanley Cohen等人首次獲得體外等人首次獲得體外重組重組DNA的分子克隆的分子克隆 1977年，年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的的化學裂解化學裂解DNA測序問世測序問世 不

2、久，不久，Sanger 等的雙脫氧測序法等的雙脫氧測序法 20世紀世紀90年代啟動人類基因組計劃年代啟動人類基因組計劃(human genome project，HGP) 重組重組DNA技術學技術學(Recombinant DNA Technology)目錄目錄第一節第一節自然界自然界DNA重組和基因轉移重組和基因轉移是經常發生的是經常發生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目錄目錄n自然界不同物種或個體之間的基因重組和基因自然界不同物種或個體之間的基因重組和基因轉移是經常發生的，它是基因變異和物種演變

3、、轉移是經常發生的，它是基因變異和物種演變、進化的基礎。進化的基礎。n基因轉移和重組也在繁殖、病毒感染、基因表基因轉移和重組也在繁殖、病毒感染、基因表達及癌基因激活等過程中起重要作用達及癌基因激活等過程中起重要作用n人類進行基因克隆、動物克隆以及基因治療等人類進行基因克隆、動物克隆以及基因治療等科學實驗和實踐中所進行的基因操作也離不開科學實驗和實踐中所進行的基因操作也離不開基因轉移和重組。基因轉移和重組。n重組重組DNA技術就是基于人們對自然界的基因轉技術就是基于人們對自然界的基因轉移和重組的認識發展起來的。移和重組的認識發展起來的。目錄目錄n基因重組基因重組（Gene re-arrangem

4、ent，recombination）n是指整段是指整段DNA在細胞內或細胞間、甚至在在細胞內或細胞間、甚至在不同物種之間進行交換，井能在新的位置上不同物種之間進行交換，井能在新的位置上復制、轉錄和翻譯。復制、轉錄和翻譯。n是自然界常見的現象，基因重組有病毒介導是自然界常見的現象，基因重組有病毒介導的基因轉移，細胞在增殖、分裂、分化過程的基因轉移，細胞在增殖、分裂、分化過程也發生基因重組或重排（也發生基因重組或重排（rearrangement）n基因重組有多種方式。基因重組有多種方式。目錄目錄DNA重組重組接合作用接合作用 (conjugation)轉化作用轉化作用 (transformatio

5、n)轉導作用轉導作用 (transduction)轉轉 座座 (transposition)同源重組同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組位點特異的重組(site-specific recombination)目錄目錄 發生在同源序列間的重組稱為發生在同源序列間的重組稱為同源重組同源重組(homologous recombination)，又稱又稱基本重基本重組（組（general recombination）。 是最基本的是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進分子同源序列間進行單

6、鏈或雙鏈片段的交換。行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組是最基本的一、同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式目錄目錄 同源重組需要一些重組蛋白和酶。如同源重組需要一些重組蛋白和酶。如RecA、B、C、D及及DNA連接酶等。連接酶等。 同源重組不依賴特異同源重組不依賴特異DNA序列，而依賴兩序列，而依賴兩分子之間的相同或相似性。若轉化或轉導分子之間的相同或相似性。若轉化或轉導獲得的外源獲得的外源DNA與宿主與宿主DNA同源同源,那么外源那么外源DNA就可以整合進宿主的染色體。就可以整合進宿主的染色體。目錄目錄nHolliday模型的模型的4個關鍵步驟：個關鍵步驟： 兩個同源染色體兩個同源染色體

7、DNA排列整齊；排列整齊；片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成對應的鏈連接，形成Holliday中間體；中間體； 通過分支移動產生異源雙鏈通過分支移動產生異源雙鏈DNA； Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體重組體DNA，分別為：，分別為：目錄目錄 片段重組體片段重組體 （見模型圖左邊產物）：（見模型圖左邊產物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈

8、，重組 體含有一段異源雙鏈區，其兩側來自同一親體含有一段異源雙鏈區，其兩側來自同一親本本DNA。 拼接重組體拼接重組體（見模型圖右邊產物）：（見模型圖右邊產物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區的兩側來自不同親本鏈區的兩側來自不同親本DNA。 目錄目錄Holliday模型中，同源重組主要模型中，同源重組主要4個關鍵步驟個關鍵步驟 兩個同源染色體兩個同源染色體DNA排列整齊排列整齊一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成對應的鏈連接，形成Holliday中間體中間體通過分支移動產生異源雙鏈通過分支移動

9、產生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體重組體DNA，分別為：，分別為：片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 目錄目錄5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體 內切酶內切酶 (recBCD)DNA侵擾侵擾(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內切酶內切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3

10、 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內切酶內切酶(ruvC)內切酶內切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體5 3 5 5 5 3 3 3 目錄目錄二、接合作用（二、接合作用（conjugation）當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相當細胞與細胞、或

11、細菌通過菌毛相互接觸時，質?；ソ佑|時，質粒DNA從一個細胞（細菌）從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱轉移稱為接合作用。為接合作用。細菌的基因轉移與重組方式細菌的基因轉移與重組方式目錄目錄 可接合質粒如可接合質粒如 F 因子因子(F factor) 細菌染色體外的小型環狀雙鏈細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子。分子。 質粒質粒目錄目錄 有的細菌染色體外有一比較大的質粒有的細菌染色體外有一比較大的質粒 - F 因因子子(F factor) ，是一個小型環狀雙鏈，是一個小型環狀雙鏈DNA。F因因子中含有性鞭毛蛋白編碼基因，這決定性鞭毛子中含有性鞭毛蛋白編

12、碼基因，這決定性鞭毛的形成。有的形成。有F因子的細菌有性鞭毛。當因子的細菌有性鞭毛。當F+和和F-的細菌相互接觸的時候，它們之間通過鞭毛的的細菌相互接觸的時候，它們之間通過鞭毛的連接構成通道，連接構成通道， F+細菌中雙連細菌中雙連DNA的一條鏈打的一條鏈打開一個缺口，進入另一個細菌，開一個缺口，進入另一個細菌， F+細菌按滾環細菌按滾環復制另一條鏈；進入復制另一條鏈；進入F-細菌的那條連做模板，細菌的那條連做模板，復制成兩條鏈，這樣兩個細菌都成為復制成兩條鏈，這樣兩個細菌都成為F+細菌。細菌。質粒質粒 細菌染色體外的小型環狀雙鏈細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子分子目錄目錄三、轉化作用三、

13、轉化作用(transformation)定義：通過自動獲取或人為地供給外定義：通過自動獲取或人為地供給外源源DNA，使細胞或培養的受體細胞獲得新，使細胞或培養的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化。的遺傳表型，稱為轉化。目錄目錄 肺炎雙球菌存在無夾膜不致病的無毒型肺炎雙球菌存在無夾膜不致病的無毒型（RH型）和有夾膜的致病型的肺炎雙球菌型）和有夾膜的致病型的肺炎雙球菌（ SH型）。提取致病型肺炎雙球菌的型）。提取致病型肺炎雙球菌的DNA，加入到加入到RH型菌里培養，型菌里培養，RH型就會轉化成致病型就會轉化成致病的的SH型型肺炎雙球菌轉化實驗：肺炎雙球菌轉化實驗：目錄目錄四、轉導作用四、轉導作用(

14、transduction)當病毒從被感染的（供體）細胞釋放當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一細胞出來、再次感染另一細胞（受體）（受體）時，發時，發生在供體細胞與受體細胞之間的生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移轉移及基因重組即為及基因重組即為轉導作用轉導作用。目錄目錄噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway) 噬菌體感染細菌時，其外殼留在細菌噬菌體感染細菌時，其外殼留在細菌的表面，噬菌體的表面，噬菌體DNA進入大腸桿菌細胞進入大腸桿菌細胞內，在細菌細胞內其生活途徑有兩

15、種：內，在細菌細胞內其生活途徑有兩種：目錄目錄噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway)目錄目錄1、溶菌生長途徑、溶菌生長途徑 (lysis pathway) DNA在細菌內復制，也可以表達產生噬在細菌內復制，也可以表達產生噬菌體的外殼蛋白，然后包裝成新的菌體的外殼蛋白，然后包裝成新的噬菌體，噬菌體，當生成大量的當生成大量的噬菌體后，細胞溶解，噬菌體后，細胞溶解， 噬菌噬菌體就釋放出來了。體就釋放出來了。目錄目錄例：例：溶菌時，裂解的溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。片段被另一細

16、菌攝取。目錄目錄 2、溶源菌生長途徑、溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway) DNA進入細菌后，可以通過基因重組整合到進入細菌后，可以通過基因重組整合到細菌染色體細菌染色體DNA中，維持下去，隨著細菌的分裂中，維持下去，隨著細菌的分裂繁殖，繁殖， DNA被擴增，當在一定條件下，這一段被擴增，當在一定條件下，這一段 DNA可以被切下來擴增、復制，進入溶菌途徑?？梢员磺邢聛頂U增、復制，進入溶菌途徑。如果如果 DNA 切下時帶有了細菌的切下時帶有了細菌的DNA,包裝成噬菌包裝成噬菌體后，新的噬菌體體后，新的噬菌體DNA就帶有細菌就帶有細菌DNA, 當其再當其再感染另外的一個細菌時，通

17、過溶源途徑，就將原感染另外的一個細菌時，通過溶源途徑，就將原細菌的細菌的DNA，帶給了新的細菌，這就是轉導作用。，帶給了新的細菌，這就是轉導作用。目錄目錄目目 錄錄目錄目錄五、位點特異重組，即特異位點間五、位點特異重組，即特異位點間發生的整合發生的整合 位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由是由整合酶整合酶催化，在兩個催化，在兩個DNA序列的特異序列的特異位點間發生的整合。位點間發生的整合。目錄目錄噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發生選擇性整合；反轉色體的特異靶位點發生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶

18、可特異地識別、整合反轉錄錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒病毒cDNA的的長末端重復序列長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合目錄目錄（二）細菌的特異位點重組（二）細菌的特異位點重組沙門菌沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變。片段倒位決定鞭毛相轉變。目錄目錄 hix為反向重復序列，它們之間的為反向重復序列，它們之間的H片段片段可在可在Hin控制下進行特異位點重組控制下進行特異位點重組(倒位倒位)。H片段上有兩個啟動子片段上有兩個啟動子P，其一驅動，其一驅動hin基基因表達，另一正向時驅動因表達，另一正向時驅動H2和和r

19、H1基因基因表達，反向表達，反向(倒位倒位)時時H2和和rH1不表達。不表達。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。目錄目錄 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重組酶重組酶轉位片段轉位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA啟動序列啟動序列H1啟動序列啟動序列沙門菌沙門菌H H片段倒位決定鞭毛相轉變片段倒位決定鞭毛相轉變目錄目錄（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩條重和兩條重鏈鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈其中兩個編

20、碼輕鏈( 和和 )，一個編碼重鏈。，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基基因的因的V-J重排均發生在特異位點上。在重排均發生在特異位點上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側片段的兩側均存在保守的重組信號序列均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基。此重排的重組酶基因因rag (recombination activating gene)

21、共有共有兩個，分別產生蛋白質兩個，分別產生蛋白質RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列重組信號序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHOHVJ單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應分子內轉酯反應單鏈切開單鏈切開轉移核苷酸轉移核苷酸修復、連接修復、連接免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程目錄目錄六、轉座六、轉座(transposition) 由插入序列和轉座子介導的基因移位或重由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為排稱為轉座轉座。 大多數基因在基因組內的位置是固定的，

22、大多數基因在基因組內的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的置。這些可移動的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和轉座子。列和轉座子。 目錄目錄 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)組成：組成：（一）插入序列轉座（一）插入序列轉座 二個分離的二個分離的反向重復反向重復(inverted repeats, IR)序列序列：941bp,位于兩側位于兩側 特有的特有的正向重復序列正向重復序列：412bp，位于反向重復，位于反向重復序列外側，為插入序列所特有。序列外側，為插入序列所特有。 一個一個轉座酶轉座酶

23、（transposase)編碼基因編碼基因：產物是轉座酶，：產物是轉座酶，引起轉座，位于中間引起轉座，位于中間長長7501500bp正向重復序列正向重復序列正向重復序列正向重復序列IRTransposase GeneIR其組成為：其組成為：目錄目錄插入序列發生轉座的形式：插入序列發生轉座的形式：1、保守性轉座、保守性轉座(conservative transposition) ：2、復制性轉座、復制性轉座(duplicative transposition)：從原位遷至新位從原位遷至新位插入序列復制后，一個復制本遷到新位，插入序列復制后，一個復制本遷到新位，另一個保留在原位。另一個保留在原位。

24、目錄目錄轉座子轉座子Transposon末端反向重復序列末端反向重復序列Terminal repeatsTarget DNATransposase makes staggered cuts in the target siteTransposase Gene1、保守性轉座、保守性轉座錯位開切錯位開切轉座子轉座子目錄目錄轉座子轉座子TransposonThe transposon is insterd at the site of the cutsReplication fills in the gapsduplicating the sequences flanking The transpo

25、son復制轉座子的旁側復制轉座子的旁側 序列，填補空隙序列，填補空隙目錄目錄2 插入序列的復制性轉座插入序列的復制性轉座目錄目錄插入序列的復制性轉座插入序列的復制性轉座目錄目錄 轉座子轉座子(transposons) 可從一個染色體可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。位點轉移到另一位點的分散重復序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）轉座子轉座（二）轉座子轉座 轉座子組成：轉座子組成： 反向重復序列反向重復序列轉座酶編碼基因轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目錄目錄 細菌的可流動性元件細菌的可流動性元件A插入序列：轉座酶編碼基因兩

26、側連接反向末端重復序列插入序列：轉座酶編碼基因兩側連接反向末端重復序列(箭頭所示箭頭所示)B轉座子轉座子Tn3：含有轉座酶、：含有轉座酶、-內酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因內酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉座子轉座子Tn10：含四環素抗性基因及兩個相同的插入序列：含四環素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L目錄目錄由轉座子介導的轉座由轉座子介導的轉座目錄目錄第二節第二節 重組重組DNA技術技術又稱又稱DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目錄目錄重組重組DN

27、A技術的發展史技術的發展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。的豌豆雜交試驗。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗。的肺炎球菌轉化實驗。1973年年 美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子。分子。1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫學上重要的技術制造醫學上重要的藥物。藥物。1980年年 開始建造第一家應用重組開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠。技術生產胰島素的工廠。1997年年 英

28、國羅林研究所成功的克隆了多莉。英國羅林研究所成功的克隆了多莉。目錄目錄相關概念相關概念n DNA克隆克隆n 工具酶工具酶n 目的基因目的基因n 基因載體基因載體基本原理基本原理 重組重組DNA技術與醫學的關系技術與醫學的關系主要內容：主要內容：目錄目錄一、重組一、重組DNA技術相關概念技術相關概念 克隆克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。貝的集合。 克隆化克隆化(cloning): 獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆分子克隆分子克隆 （DNA克隆）克隆）細胞克隆細胞克隆 個體克隆個體克隆 （

29、動物或植物）（動物或植物） 技術水平技術水平目錄目錄應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的DNA）與載體）與載體DNA結合成具有結合成具有自我復制能力的自我復制能力的DNA分子分子復制子復制子(replicon)即即重組體重組體，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或基因克隆或重組重組

30、DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆各種來源的各種來源的DNA即目的即目的DNA,也叫外源也叫外源DNA目錄目錄 生物技術工程生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、酶基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等工程、細胞工程等 目的：目的： 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質） 基因工程基因工程(genetic engineering) 實現基因實現基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組又稱重組DNA技術技術 / 重組重組DNA工藝

31、學。工藝學。目錄目錄（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶（基因工程中重要的酶）（基因工程中重要的酶） DNA聚合酶聚合酶 逆轉錄酶逆轉錄酶 DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉移酶末端轉移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶(PCR技術中應用的一種耐熱的技術中應用的一種耐熱的 DNA聚合酶，聚合酶，95度不變性度不變性)重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端

32、之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標記等末端標記等反轉錄酶反轉錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標記

33、或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶在在3 羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目錄目錄識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。是細菌內是細菌內存在的保護性酶，如果有外來的DNA進入細菌內，則RE將其水解掉，對細菌自身起保護作用。限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶（restriction endonuclease，RE) 目錄目錄發現發現n19701970年，美國的年

34、，美國的Hamilton SmithHamilton Smith偶然發現，流感嗜血桿偶然發現，流感嗜血桿菌（菌（HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenzae Rd Rd）能降解外源噬菌體）能降解外源噬菌體DNADNA，且該菌的無細胞的抽提液也具有降解（酶）活性。，且該菌的無細胞的抽提液也具有降解（酶）活性。n該酶能降解該酶能降解E.coliE.coli DNA DNA，但不降解產生該酶的，但不降解產生該酶的HaemophilusHaemophilus自身細胞自身細胞DNADNA，稱該酶為，稱該酶為HindHind，能結合并，能結合并識別的識別的DNAD

35、NA序列為序列為：n限制性內切酶能夠在限制性內切酶能夠在DNADNA上尋找特定的位點切斷雙鏈，上尋找特定的位點切斷雙鏈，被稱為被稱為“分子剪刀”。目錄目錄 特點特點1 1）均來自微生物，并據此而進行命名；）均來自微生物，并據此而進行命名；2 2）特異識別連續的）特異識別連續的4 4、6 6或或8 8個堿基；個堿基；n按其識別順序可以計算切割幾率：按其識別順序可以計算切割幾率：n假定四種堿基在假定四種堿基在DNADNA鏈上隨機分布，則識別鏈上隨機分布，則識別4 4、6 6、8 8個堿基個堿基順序出現的幾率分別是順序出現的幾率分別是1/441/44、1/461/46、1/481/48（識別順序出現

36、（識別順序出現的堿基間隔）。的堿基間隔）。n識別序列越長、切點越少。識別序列越長、切點越少。3 3）識別序列多具有回文結構（）識別序列多具有回文結構（palindromepalindrome）；即識別序列呈二元）；即識別序列呈二元旋轉對稱。旋轉對稱。n回文結構多數不是重要的結構基因?；匚慕Y構多數不是重要的結構基因。4 4）其切割后的）其切割后的DNADNA可產生不同的末端。可產生不同的末端。目錄目錄 作用：作用：GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 分類：分類：、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型） 與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系與甲基化酶共同構成細菌的

37、限制修飾系統，限制外源統，限制外源DNA，保護自身，保護自身DNA。回文結構回文結構目錄目錄第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。用羅馬數字表示發現的先后次序。 命名：命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶目錄目錄I：切割位點：非特異性，跟識別位點大于：切割位點：非特異性，跟識別位點大于1000bpII

38、: 同于或接近于識別部位同于或接近于識別部位III: 跟識別位點跟識別位點3端端24-26bp處處切割位點：切割位點：目錄目錄 限制修飾系統限制修飾系統(Restriction and Modification System)n限制性核酸內切酶與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源DNA，保護自身DNA目錄目錄類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結構(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目錄目錄二元旋轉對稱，即從到的方向閱讀是完全相同的二元旋轉對稱，即從到的方向閱讀是完全相同的5 3 識別的回文結構為短小序列大多為識別的回文結構為短小序列大多

39、為4-6bp4-6bp回文結構指的是：二元旋轉對稱回文結構指的是：二元旋轉對稱(180(180度旋轉度旋轉) )，即點對稱，即點對稱注意：線對稱不是回文結構注意：線對稱不是回文結構目錄目錄Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口目錄目錄n限制性核酸內切酶識別序列長度為限制性核酸內切酶識別序列長度為48個bp，6個最多見。n不同酶切產生的相同粘性末端稱不同酶切產生的相同粘性末端稱配伍配伍末端末端（compatible end),可用連接酶連接?？捎眠B接酶連接。粘性末端粘性末端端突出端突出端

40、突出端突出5 3 5 AATTC 3 G 5 G 3 AATTC 目錄目錄S A T O RA R E P OT E N E TO P E R AR O T A S具有反向重復序列的是：A、CGGTAGCTAGTTCGB、CGAGGATTAGGAGCC、AAGGTTCGAACCTTD、TTACGTATTACGTA目錄目錄來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶：同功異源酶：目錄目錄有些限制

41、性內切酶雖然識別序列不完全有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名稱名稱 識別序列及切割位點識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點名稱識別序列及切割點切割后產生切割后產生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR

42、EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 HpaHpa 5CCGG.3CGG.3 MboMbo 5GATC.3GATC.3 NdeNde 5GATATG.3TATG.3切割后產生切割后產生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPyPy.3.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產生平末端切割后產生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3HaeHae 5GGCC.3CC.3PvuPvu 5CAGCTG.3C

43、TG.3SmaSma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內切核酸酶限制性內切核酸酶目錄目錄（三）目的基因（三）目的基因(target gene) 應用重組應用重組DNA技術所要分離、獲得的基因。技術所要分離、獲得的基因。 應用重組應用重組DNA技術的目：技術的目：1、為分離、獲得某種感興趣的基因或、為分離、獲得某種感興趣的基因或DNA序列，即目的基因（序列，即目的基因（target DNA）或外源）或外源DNA。2 為獲得目的基因的表達產物為獲得目的基因的表達產物 蛋白質蛋白質目錄目錄 cDNA (complementary DNA)雙稱互補雙稱互補DNA 指經反轉錄合成的、與指經反轉錄合成

44、的、與RNA (通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互補的單鏈互補的單鏈DNA。以單鏈。以單鏈cDNA為模板、經聚合反應可合成雙鏈為模板、經聚合反應可合成雙鏈cDNA。 基因組基因組DNA (genomic DNA) 指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體染色體及線粒體)的所有的所有DNA序列。序列。 目的基因的類型：目的基因的類型：DNADNA克隆時構建的嵌合體克隆時構建的嵌合體DNADNA組成包括：組成包括：載體載體DNA+DNA+目的目的DNADNA目錄目錄獲取目的基因的方法：獲取目的基因的方法：1、直接從組織或細胞染色體DNA中分離，限

45、制性酶切；2、利用DNA合成儀化學法合成，或用PCR法擴增；3、提取mRNA反轉錄合成cDNA直接克隆，或建立c-文庫再從中篩選。4、利用鳥槍法建立G-文庫，再用核酸探針從基因文庫中“釣”取。5、PCR方法目錄目錄（四）基因載體（四）基因載體 定義定義能攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達能攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的可獨立復制的完整有意義的蛋白質所采用的可獨立復制的完整的一些的一些DNA分子。又稱分子。又稱克隆載體克隆載體。其中為表。其中為表達出蛋白質設計的載體又稱達出蛋白質設計的載體又稱表達載體表達載體。 常用載體常用載體質粒質粒DNA、噬菌體、噬菌體DNA、病毒

46、、病毒DNA目錄目錄克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設計的載體稱為設計的載體稱為克隆載體克隆載體。(大量獲得基因片段大量獲得基因片段)表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成序列可轉錄翻譯成 多肽鏈而特意設計的載體稱為多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體表達載體。(大量獲得表達產物大量獲得表達產物)目錄目錄n載體的選擇標準：載體的選擇標準：能自主復制；能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；的

47、篩選和鑒定；有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNA插入點），常具有插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多個單一酶切位點，稱為多克隆位點多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。目錄目錄理想基因載體應具備的條件理想基因載體應具備的條件n可在宿主細胞內自行復制（具有自身的復制子并能攜帶外源性DNA一同擴增）；n有多種限制性核酸內切酶的單一切割位點（多克隆位點）；n載體分子應盡可能小，可插入較大的外源DNA而不影響復制；n有兩個以上的篩選標記（抗藥性、酶基因、營養缺陷型、形成嗜菌斑等）。n拷貝數多、與宿主易于分離、抗剪切力強。n表達型載體應配備與宿主細胞適應的啟動子、

48、前導順序、增強子等。目錄目錄1.1.質粒質粒 (plasmid)特點特點: : 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 是存在于細菌染色體外的小型環狀雙鏈是存在于細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子。分子。大小約為數千大小約為數千堿基對。常有堿基對。常有13個抗藥性個抗藥性基因，以利于基因，以利于篩選，能加篩選，能加0.110kb的基因的基因目錄目錄n以大腸桿菌中的質粒載體為例：n大腸桿菌有一套自己的染色體，在染色體之外還有一環狀DNA拿出來，因為它體積小，容易操作，通過人工改造變

49、成載體。載體有幾個重要部分：n1、用來復制的部分：克隆的話需要復制，要有調控的元件n2、人工改造的部分，用來篩選轉到細胞是否成功。因為這一段的編碼產物可以對抗抗菌素對宿主細胞的殺傷。如氨芐青霉素抗性基因，根據需要的不同選擇不同的抗性基因。n3、裝上Lac Z基因：乳糖操縱子，外界給了乳糖，可變成半乳糖，如果沒有葡萄糖 Lac Z 如果成功轉到大腸桿菌，就會產生n在含有 X-gal 、IPTG的培養基培養，B-半糖苷酶分解X-gal 的顯色反應很靈敏。 B-半糖苷酶可以分解X-gal 變成藍色，如果這個基因遭到破壞，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色， IPTG半乳糖的類似物，很有

50、效地啟動乳糖操縱子的基因轉錄。人工構建質粒人工構建質粒PBR322全長全長4363堿基對，堿基對，有一個復制起始點，有一個復制起始點，2個抗生素的抗性基因個抗生素的抗性基因（氨芐青霉素抗性基因、（氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因）四環素抗性基因）有多個單一的酶切位點有多個單一的酶切位點目錄目錄 噬菌體噬菌體DNA改造系統改造系統 gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克隆克隆目的基因較小目的基因較?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆系列（置換型，適用基因組克隆目的基因目的基因較在大較在大）2.2.噬菌體噬菌體(phage) M13 噬菌體噬菌體DNA改造系統（改造系統（含含l

51、acZ基因基因） M13mp系列系列 pUC系列系列目錄目錄n對 噬菌體噬菌體DNA中間部分進行改造，替換原來的結構基因，裝上目的基中間部分進行改造，替換原來的結構基因，裝上目的基因，利用它容易感染原核和真核細胞的性質，把目的基因帶進去，其容因，利用它容易感染原核和真核細胞的性質，把目的基因帶進去，其容量高，量高，8020Kbn病毒載體用的越來越多，因為病毒感染細胞的效率非常高（如，大腸桿病毒載體用的越來越多，因為病毒感染細胞的效率非常高（如，大腸桿菌載體效率不高菌載體效率不高）而病毒幾乎百分之百。）而病毒幾乎百分之百。n病毒依靠表面的蛋白質與宿主細胞結合，去感染，把它的內容物釋放到宿主細胞內

52、。病毒基因組在兩頭有包裝信號，中間是病毒的結構基因，第一步改造是把兩頭的結構信號拿掉，僅把結構基因重組，轉到宿主細胞，能轉成功的話，進入的全是結構基因與宿主的基因組整合，利用宿主的一切系統，把它的所有基因產物表達出來，在胞漿呆著，叫包裝細胞；第二步，包裝信號與目的基因重組，然后再與載體重組，轉染到剛才已經建好的包裝細胞中。包裝信號是與目的基因連在一起的，利用宿主的基因組不斷復制更多的帶目的基因和包裝信號的片段，這些片段當它與與已經有了的病毒蛋白相遇，包裝信號發揮作用，可以包裝成新的病毒（含有目基因但沒有病毒的結構基因了），有感染力但無結構基因了。目錄目錄 柯斯質?？滤官|粒(cosmid)酵母人

53、工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細菌人工染色體細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒動物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）3、其他其他目錄目錄 粘性質粒粘性質粒(cosmid)目錄目錄二、重組二、重組DNA技術基本原理技術基本原理 基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導入受體細胞導入受體細胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建克隆載體的選擇和構建重組體的篩

54、選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 目錄目錄如果要獲得一個如果要獲得一個DNA克隆，操作：克隆，操作：1、從真核生物染色體、從真核生物染色體DNA中中獲取目的獲取目的DNA。2、基因、基因載體載體的選擇和構建，如質粒。的選擇和構建，如質粒。3、將載體和目的基因用同一種限制性內切酶來、將載體和目的基因用同一種限制性內切酶來切割，產生相同的粘性末端。切割，產生相同的粘性末端。4、切割后將載體與目的基因連接起來（外源基因、切割后將載體與目的基因連接起來（外源基因與載體的并接成與載體的并接成重組體重組體）。）。5、將重組體、將重組體導入受體細菌（細胞）導入受體細菌（細胞）。6、篩選出含有重組體

55、的轉化子細胞篩選出含有重組體的轉化子細胞，并無性繁殖，并無性繁殖重組體的目的基因（細菌重組體的目的基因（細菌擴增擴增得到得到DNA克隆）?？寺。?。7、如果要獲得蛋白質，最終還需要表達。、如果要獲得蛋白質，最終還需要表達。目錄目錄Host宿主細胞E.Coli the “factory” used in the genetic engineering of insulin目錄目錄n有了基因有了載體，要想最終實現獲得大量基因或產物，最終都要放到host cells實現。最常用的有3類：大腸桿菌、單細胞的真核生物（酵母B4）真核哺育類細胞。n拿基因根據目的不同，取的組織或細胞不同 以以 質質 粒粒 為

56、為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程目錄目錄（一）目的基因的獲取（一）目的基因的獲取分分1. 化學合成法化學合成法（化學合成儀）（化學合成儀） 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列的氨基酸序列 ；或可推導出序列的基因，；或可推導出序列的基因，如胰島素的基因、干擾素的基因。如胰島素的基因、干擾素的基因。2. 基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) (見第見第2

57、2章章) 目錄目錄1 1 化學合成法獲取目的基因化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。目錄目錄組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉化菌含重組分子的轉化菌限制性內切酶限制性內切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉化細菌內，存在于轉化細菌內，由克隆載體所攜帶的所有由克隆載體所攜帶的所有基因組基因組DNA的集合。的集合。簡稱簡稱G文庫。文庫。它表達了細胞整套基因。它表達了細胞整套基因。2、從基因組、從基因組DNA文庫獲文庫獲取目的基因取目的基因目錄目錄基因文庫：基因

58、文庫：n提純生物體全部DNA，用限制性內切酶隨機切割成大致相同的數以萬計的片段，重組入同一類載體上，轉化宿主菌保存，即得基因文庫。n（1） G-文庫：n用基因組總DNA制備的基因庫。n（2） c-文庫：n用細胞全部mRNA經反轉錄制備全套cDNA后建立的基因庫。G-文庫比 c-文庫基因數目多目錄目錄n就研究一個基因，而且知道這個基因組織中是表達的，表達量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑電泳，成功的 RNA是5.8S 18S 28S三個條帶非常清楚，如果5.8S不清楚，湊合用，如果28S 18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA實驗時要在一個獨立的空間，所有東西都獨立，

59、不能與別的實驗混合。得到的是總RNA，我們需要的是mRNA， mRNA尾巴上有polyA ，利用這個特別純化，去掉tRNA、 rRNA，有了mRNA為模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相當穩定，可以長期保存下來。n有了cDNA，酶、引物、底物通過PCR技術，大量擴增。由于知道想做的這段基因的分子量，如果想知道這段基因的分子量，跑電泳，就可以大概知道拿到的這段基因是不是想要的基因，如果與理論基因分子量是對應的，那就可能是，最終的結論還需要測序。n如果是想要的基因，與載體重組，重組后轉到細胞內，轉到細胞有三種方法：化學的、物理的，生物的 。物理的方法比較簡單有基因槍，電轉；化

60、學的方法，比如用Ca2+Cl2處理細胞，細胞表面的膜變得疏松，載體容易進入。質子體感染、病毒感染等都可以轉入細胞n是否轉進去，就開始篩。用抗生素先篩質粒是否轉進去了，再用藍白斑篩目的基因是否進去（藍斑沒有進去，白斑進去了）限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb