1、1 史史 娟娟醫(yī)科院基礎(chǔ)所醫(yī)科院基礎(chǔ)所 新科研樓新科研樓607607E-mail: E-mail: 細胞凋亡和細胞自噬細胞凋亡和細胞自噬23Outline1. History of apoptosis research2. Characterization of apoptosis3. Physiological Significances4. Apoptosis Signaling Pathways5. Regulation of Apoptosis6. Apoptosis and Autophagy4第一節(jié)第一節(jié) 凋亡的研究歷史凋亡的研究歷史1842 Carl Voget Initial

2、observation that cell death in part of normal development1972 Kerr, Wyllie and Currie- - introduced term apoptosis to describe cell death with a set of common morphological features - Cell deletion was controlled under physiological conditions in adults - Deregulation could lead to many diseases - M

3、orphologically identical to developmental CD and distinct from accidental cell death51980 Wyllie Biochemical changes in apoptotic morphology: - DNA fragmentation -Requires expression of death genes1988 Bcl-2 was found to be anti-apoptotic1991 ced genes were identified in C. elegan1992 Fas/APO-1/CD95

4、 was identified1993 A role of p53 in regulation of apoptosis was described Fas ligand was identified ICE was found to be homolog of ced-3 in mammalian IAPs were identified1994 The role of mitochondria during apoptosis1996 The role of caspases during apoptosis Release of cytochrome c from mitochondri

5、a during apoptosis was discovered1997 Apafs were identified 6 Nobel Prize 2002 in Physiology and Medicine Sydney Brenner John E. Sulston Robert H. Horvitz for their discoveries concerninggenetic regulation of organ development and programmed cell death7“Genetic control of programmed cell death in th

6、e nematode Caenorhabditis elegans”“You can observe a lot by watching.” Y. Berra8第二節(jié)第二節(jié) 凋亡細胞的特征凋亡細胞的特征 9凋亡凋亡(apoptosis)(apoptosis)的形態(tài)學(xué)特征為染色質(zhì)凝集、邊的形態(tài)學(xué)特征為染色質(zhì)凝集、邊緣化，細胞皺縮，細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻，緣化，細胞皺縮，細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻，細胞出泡形成凋亡小體。細胞凋亡受到一系列相關(guān)細胞出泡形成凋亡小體。細胞凋亡受到一系列相關(guān)基因的嚴格調(diào)控。基因的嚴格調(diào)控。程序性細胞死亡（程序性細胞死亡（programmed cell death

7、programmed cell death，PCDPCD），），即是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身即是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，主動結(jié)束其生命的過程，這種死亡由基因的程序，主動結(jié)束其生命的過程，這種死亡由基因決定的。大多數(shù)程序性細胞死亡，呈現(xiàn)細胞凋亡的決定的。大多數(shù)程序性細胞死亡，呈現(xiàn)細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。形態(tài)學(xué)特征。10NecrosisApoptosis11細胞凋亡與細胞壞死在形態(tài)上的主要區(qū)別 細胞凋亡 細胞壞死發(fā)生條件 多為生理性 病理性（偶然刺激） 單個細胞丟失 成群細胞死亡細胞膜 發(fā)泡，完整 破裂，不完整細胞器 結(jié)構(gòu)保留 破壞細胞核 核凝集斷裂 核破碎溶

8、解 染色質(zhì)均一濃縮細胞 皺縮形成凋亡小體 細胞膨脹而溶解 被鄰近正常和巨噬細胞吞噬 殘余碎片被巨噬細胞吞噬炎癥反應(yīng) 無，不釋放內(nèi)容物 有，釋放內(nèi)容物12細胞凋亡與細胞壞死在生物化學(xué)方面的主要區(qū)別 細胞凋亡 細胞壞死基因調(diào)節(jié) 由凋亡相關(guān)基因調(diào)控 與基因調(diào)控?zé)o關(guān)發(fā)生條件 多為生理性 病理性（偶然刺激） 能量 需要能量 不需要能量新的基因轉(zhuǎn)錄 有 無大分子合成 需要 不需要Caspase 依賴性 不依賴DNA 降解為180-200bp DNA隨機性降解成為任意 的整數(shù)倍的DNA Ladder 長度的片段細胞膜 磷脂酰絲氨酸外翻13Morphology of Apoptotic Cell14Apopt

9、osisNecrosisApoptosis Apoptosis VS.VS. Necrosis Necrosis1516第三節(jié)第三節(jié) 細胞凋亡的生理學(xué)細胞凋亡的生理學(xué) 病理學(xué)意義病理學(xué)意義 17 保證個體正常發(fā)育：蝌蚪成蛙、昆蟲蛻變、淋巴細胞保證個體正常發(fā)育：蝌蚪成蛙、昆蟲蛻變、淋巴細胞陽性和陰性選擇、表皮和指（趾）甲的形成等。陽性和陰性選擇、表皮和指（趾）甲的形成等。 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除衰老細胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除衰老細胞、DNADNA損傷的細胞等。損傷的細胞等。如果機體對受損、突變或者衰老的細胞不能及時清除如果機體對受損、突變或者衰老的細胞不能及時清除話，就會干擾內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。話，就會干

10、擾內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。 防御功能：清除被病原體感染的細胞等。防御功能：清除被病原體感染的細胞等。生理學(xué)意義生理學(xué)意義18 保證個體正常發(fā)育：蝌蚪成蛙、昆蟲蛻變、淋巴細胞陽性和陰性選擇、表皮和指（趾）甲的形成等。19 Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis. Tissue remodeling. 20脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育21 CTL殺傷靶細胞。22免疫細胞凋亡免疫細胞凋亡 細胞凋亡:95%的細胞凋亡 胸腺細胞成熟過程中的凋亡 陽性選擇 陰性選擇 激活誘導(dǎo)的細胞凋亡：（activation-induced cell d

11、eath，AICD） CTL誘導(dǎo)靶細胞的凋亡： 穿孔素介導(dǎo)的靶細胞凋亡 Fas介導(dǎo)的靶細胞凋亡 23lymphoid progenitor (CLP)double negative (DN)double positive (DP)Apoptosis and survival during T lymphocyte development24Apoptosis and survival during B lymphocyte development25 物理因素：物理因素：X-X-射線、熱休克等；射線、熱休克等； 化學(xué)因素：過氧化氫、乙醇、化學(xué)因素：過氧化氫、乙醇、8 8氯腺苷、氨氯腺苷、氨 甲

12、蝶呤、苯丁酸氮芥、三尖杉酯堿等；甲蝶呤、苯丁酸氮芥、三尖杉酯堿等； 生物因素：某些細胞因子表達水平變化、蛋白分生物因素：某些細胞因子表達水平變化、蛋白分 子的激活、修飾、降解或構(gòu)象改變、子的激活、修飾、降解或構(gòu)象改變、 活性氧的產(chǎn)生等。活性氧的產(chǎn)生等。Apoptosis Inducers26 病原體侵染；病原體侵染；誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)凋亡HIVHIV抑制凋亡抑制凋亡PoxvirusPoxvirus 細胞凋亡不足細胞凋亡不足腫瘤，自身免疫疾病；腫瘤，自身免疫疾病； 細胞凋亡過度細胞凋亡過度神經(jīng)退行性疾病（神經(jīng)退行性疾病（ADAD，帕金森癥）、心肌梗塞、，帕金森癥）、心肌梗塞、 再生再生障礙性貧血、骨組

13、織壞死。障礙性貧血、骨組織壞死。病理學(xué)意義病理學(xué)意義27HIV infection causes apoptosis28接受凋亡信號接受凋亡信號蛋白水解酶（蛋白水解酶（caspasescaspases）的活化）的活化凋亡的級聯(lián)反應(yīng)凋亡的級聯(lián)反應(yīng)凋亡調(diào)控分子間的相互作用凋亡調(diào)控分子間的相互作用第四節(jié)第四節(jié) 細胞凋亡的信號傳遞細胞凋亡的信號傳遞29 細胞外部刺激信號介導(dǎo)的死亡受體信號細胞外部刺激信號介導(dǎo)的死亡受體信號傳遞途徑傳遞途徑( (extrinsicextrinsic) ) 細胞內(nèi)部的信號傳遞途徑細胞內(nèi)部的信號傳遞途徑 ( (intrinsic or mitochondrial)intrin

14、sic or mitochondrial) 30連接分子（連接分子（ adaptoradaptor）：）：具有一些特殊的功能結(jié)構(gòu)域，如具有一些特殊的功能結(jié)構(gòu)域，如 DDDD、DEDDED、CARDCARD等，等，同種結(jié)構(gòu)域間具有相互結(jié)合的傾向同種結(jié)構(gòu)域間具有相互結(jié)合的傾向31The TNF and TNFR superfamiliesAggarwal BB。Nat Rev Immunol. 2003，3(9):745-5632CRD：Cys-rich repeats extracellular DD： death domain cytoplasmic essential3334Structur

15、e of Death Receptors胞外區(qū)結(jié)構(gòu)相似，有多個富含半胱氨酸保守序列；胞內(nèi)區(qū)均有特殊死亡功能區(qū)（約90個氨基酸殘基組成的基序, death domain, DD）；死亡功能區(qū)無任何酶活性，但可與具有相似死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合。35Mechanisms of TRAIL FunctioningMechanisms of TRAIL Functioning Two functional death receptors (DR4/DR5) Three decoy receptors (DcR1, DcR2 & OPG) Homotrimer； Capase cascade36AP

16、P binds DR6 to trigger axon degenerationand neuron death via distinct caspasesNikolaev A, et al. Nature. 2009;457(7232):981-9.37Caspase 1 ICECaspase 2 ICH-1/Nedd-2Caspase 3 CPP32/YamaCaspase 4 TX ICH-2 ICErel IICaspase 5 ICErel III TyCaspase 6 Mch-2Caspase 7 Mch-3Caspase 8 MACH FLICE Mch-5Caspase 9

17、ICE/LAP6 Mch-6Caspase 10 Mch-4 FLICE-2Caspase 11 ICH3Caspase 12 ER apoptosis-specificCaspase 13 ERICECaspase 14 MICECaspase 15Caspase 16Caspase 17Caspase 18Caspases: cysteine aspartic acid specific protease “C” = cysteine, “asp” = cleave after Asp; family of proteases with similar amino acid sequenc

18、e, structure, substrate specificity38根據(jù)根據(jù)Caspase Caspase 家族成員之間大小亞單位的同源性家族成員之間大小亞單位的同源性, , 可將他們分為可將他們分為3 3 組組: : 炎癥組（炎癥組（inflammatory mediatorsinflammatory mediators）:Caspase1,4,5,12,13,14 :Caspase1,4,5,12,13,14 凋亡起始組（凋亡起始組（apoptotic initiatorsapoptotic initiators）：）：Caspase2,8,9,10 Caspase2,8,9,10

19、凋亡效應(yīng)組（凋亡效應(yīng)組（apoptotic executionersapoptotic executioners）：）：Caspase3,6,7Caspase3,6,7DED: death effector domainCARD: caspase recruitment domain 39Structure and Function of CaspasesDED: death effector domainsCARD: caspase recruitment domains40 Caspases are produced as zymogensLavrik IN, J Clin Invest.

20、 2005;115:2665-7241Scheme of procaspase-8 processing at the CD95 DISC Lavrik IN, J Clin Invest. 2005;115:2665-7242Mechanisms of Caspase Activation自活化自活化(autoactivation)(autoactivation)是指是指部分部分Caspase Caspase 酶原具有在高濃酶原具有在高濃度或局部高濃度時形成寡聚復(fù)度或局部高濃度時形成寡聚復(fù)合體可自身激活自身的特性。合體可自身激活自身的特性。主要為凋亡起始組成員主要為凋亡起始組成員, ,。轉(zhuǎn)活

21、化（轉(zhuǎn)活化（transactivationtransactivation）是已激活的起始是已激活的起始Caspase Caspase 激活激活其它其它Caspase Caspase 酶原的方式。酶原的方式。非非Caspase Caspase 蛋白酶活化是蛋白酶活化是Caspase Caspase 酶原激活的另一方式。酶原激活的另一方式。例如例如Granzyme BGranzyme B。43 Activation model of caspases44How caspases kill ICAD&CAD(the inhibitor of Caspase- activated DNase)

22、 Lamins, causing lamina to collapse and contributing to chromatin condensation. Cytoskeletons, cell junctions Deregulation of protein activity454647Regulation of Caspases Gene expression Phosphorylation, nitrosylation a. Inactivation of human caspase-9 by Akt; b. Direct inhibition of caspase activit

23、y through active site nitrosylation Bcl-2 protein family: pro- vs. anti-; Caspase inhibitors: a.痘苗病毒痘苗病毒CrmA and p35; b. FLIPs; c. IAPs48Dual Functions of Caspase-8Expression and phosphorylation state of caspase-8 in tumors: prognostic marker or to pharmacologically stimulate caspase-8 processing fo

24、r tumor therapyFrisch SM Cancer Res 2008; 68:4491-349Signal Transduction by death receptorsAshkenazi A. Nat Rev Cancer. 2002;2(6):420-3050Immunol Cell Biol (2006) 84, 879851 Intrinsic Signaling Pathway Activation requires: - Cytochrome c release - ATP/dATP - Apaf-1 - Cyt c/Apaf-1/procaspase- 9/ATP(d

25、ATP) apoptosome - Caspase-9 activation Extrinsic Signaling Pathway Activation requires: - death receptor - adaptor proteins(FADD/ TRADD) - DISC (death-inducing signaling complex ) - Caspase-8/10 activation52Central role of mitochondria in apoptosis- 線粒體跨膜通道線粒體跨膜通道 (permeability transition (permeabil

26、ity transition pore , PTpore , PT孔孔) ) 的開放的開放- 線粒體跨膜電位下降，線粒體跨膜電位下降，Cyt c Cyt c 釋放釋放- Cyt c/Apaf-1/procaspase- Cyt c/Apaf-1/procaspase- 9/dATP apoptosome 9/dATP apoptosome- Caspase Caspase級聯(lián)級聯(lián)- Smac Smac釋放釋放53Structure of Apaf-1Apaf-1: apoptotic protease activating factor-1 5455Inflammasome in inflam

27、mation5657Finkel, Science. 2001; 292(5517):624-626. 線粒體線粒體PT孔主要由位于內(nèi)膜的腺苷孔主要由位于內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子轉(zhuǎn)位因子ANT和位于外膜的電壓依賴和位于外膜的電壓依賴性陰離子通道性陰離子通道VDAC等蛋白所組成，等蛋白所組成，PT孔開放會引起線粒體跨膜電位下孔開放會引起線粒體跨膜電位下降和降和cyt c、凋亡因子、凋亡因子AIF等釋放。等釋放。Bcl-2家族蛋白對于家族蛋白對于PT孔的開放和關(guān)孔的開放和關(guān)閉起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，促凋亡蛋白閉起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，促凋亡蛋白Bax等可以通過與等可以通過與ANT或或VDAC的結(jié)的結(jié)合介導(dǎo)合介導(dǎo)PT

28、孔的開放，而抗凋亡類蛋孔的開放，而抗凋亡類蛋白如白如Bcl-2、Bcl-xL等則可通過與等則可通過與Bax競爭性地與競爭性地與ANT結(jié)合，或者直接結(jié)合，或者直接阻止阻止Bax與與ANT、VDAC的結(jié)合來發(fā)的結(jié)合來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。揮其抗凋亡效應(yīng)。58Synergism between extrinsic and intrinsic death pathways by caspase-processed Bid 4 Cross-talk and integration between death-receptor and mitochondrial pathways4 Under some co

29、nditions cross-talk is minimalthe two pathways operate independently4 Caspase processing of Bid induces translocation of processed Bid to mito, where it promotes cytochrome c releaseHengartner, Nature 407: 770, 20005960Stefan J. Riedl Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 897-907Pathways to cell

30、death in C. elegans, Fruitflies and mammals 61Bcl-2基因家族基因家族IAP家族家族FLIP家族家族其他：其他：HSP、NF-kBP53第五節(jié)第五節(jié) 細胞凋亡的基因表達調(diào)控細胞凋亡的基因表達調(diào)控6263Apoptosis Regulators in Bcl-2 Family64Bcl-2亞家族：抑制細胞凋亡的發(fā)生，結(jié)構(gòu)上擁有保守的亞家族：抑制細胞凋亡的發(fā)生，結(jié)構(gòu)上擁有保守的BH1BH4的結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū), BH1與與BH2結(jié)構(gòu)域是抗凋亡蛋白必備的結(jié)構(gòu)域，同時在同源或異源性二聚體和離子通道結(jié)構(gòu)域是抗凋亡蛋白必備的結(jié)構(gòu)域，同時在同源或異

31、源性二聚體和離子通道 的形成中發(fā)揮重要的作用，主要包括的形成中發(fā)揮重要的作用，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W和和Mcl-1等；等；Bax亞家族：促進細胞凋亡，結(jié)構(gòu)上缺乏亞家族：促進細胞凋亡，結(jié)構(gòu)上缺乏BH4結(jié)構(gòu)域，只含結(jié)構(gòu)域，只含BH1BH3和跨膜區(qū)，包括和跨膜區(qū)，包括 Bax、Bak、Bok；BH3亞家族：促進細胞凋亡，結(jié)構(gòu)上僅具有亞家族：促進細胞凋亡，結(jié)構(gòu)上僅具有1個保守的個保守的BH3同源結(jié)構(gòu)域，主要包括同源結(jié)構(gòu)域，主要包括Bad、 Bim、Bid和和Bik等。等。Structure and Function of Bcl-2 Family ProteinsValentij

32、n AJ, Biochem Soc Trans. 2004;32(Pt3):421-565Antiapoptotic members: BCL-2, BCL-XL, A1, MCL-1, etc.Proapoptotics: BID, BAD, BIM, BIK, BMF, NOXA, PUMA, etc.66Models for interaction between BH3-only proteins, BAX/BAK-like proteins and pro-survival BCL-2-family members in signalling in apoptosis.Strasse

33、r A.Nat Rev Immunol. 2005;5(3):189-200. 67Small molecules convert anti-death factors into pro-death factorsnature chemical biology 2008 12(4):7226869Inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) IAP (XIAP, c-IAP-1, c-IAP-2, Survivin, Livin): to bind with pro-caspase and inhibit the activation of caspases;

34、 IAP inhibitors： Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pH), to bind with IAPs and activate caspase-9 Omi/HtrA270Structure of BIR domain-containing IAPsRiedl SJ, Nat Rev Mol Cell Biol. 2004;5(11):897-907. BIRBIR一般由一般由8080個氨基酸殘基構(gòu)成個氨基酸殘基構(gòu)成, ,全

35、全稱為桿狀病毒稱為桿狀病毒IAPIAP重復(fù)序列重復(fù)序列( baculoviral IAP repeat),( baculoviral IAP repeat),為為IAP IAP 抑制細胞凋亡所必需的，也是所有抑制細胞凋亡所必需的，也是所有IAPIAP家族蛋白共有的結(jié)構(gòu)域。事實上含家族蛋白共有的結(jié)構(gòu)域。事實上含BIRBIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在許多真核生物中都結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在許多真核生物中都可以見到，但并不是所有含可以見到，但并不是所有含BIRBIR結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域的蛋白都能夠抑制凋亡。的蛋白都能夠抑制凋亡。 RINGRING結(jié)構(gòu)是存在于部分結(jié)構(gòu)是存在于部分IAPIAP蛋白羧基蛋白羧基末端的鋅指樣結(jié)構(gòu)單元

36、。這種鋅指樣末端的鋅指樣結(jié)構(gòu)單元。這種鋅指樣結(jié)構(gòu)具泛素酶活性結(jié)構(gòu)具泛素酶活性, ,能夠促進能夠促進caspasecaspase的降解的降解, ,參與凋亡抑制作用。參與凋亡抑制作用。 少數(shù)少數(shù)IAPIAP分子存在分子存在CARDCARD結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu), ,是位于是位于IAPIAP分子分子BIRBIR結(jié)構(gòu)和鋅指結(jié)構(gòu)之間的一結(jié)構(gòu)和鋅指結(jié)構(gòu)之間的一段序列段序列, ,目前尚未證明目前尚未證明CARDCARD結(jié)構(gòu)與抑制結(jié)構(gòu)與抑制凋亡有關(guān)。凋亡有關(guān)。71Molecular mechanism of IAP-mediated inhibition of effector caspases.Reial SJ et a

37、l., Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Nov;5(11):897-907. 72the Multiple mechanisms of IAPsJesenberger V, Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3(2):112-21 73Krammer PH, Nat Rev Immunol. 2007;7(7):532-42. Structure of cFLIP (FLICE inhibitor protein) familyDED domain 74Regulation of NF-kB activation by cFLIP 75Mathew

38、 R, Clin Cancer Res. 2006;12(12):3648-51.76Regulation of NF-kB on cell survival and apoptosis77熱激蛋白熱激蛋白(heat shock protein(heat shock protein，HSP)HSP) 除參與細胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象、穩(wěn)定性及激除參與細胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象、穩(wěn)定性及激酶活性調(diào)節(jié)之外，酶活性調(diào)節(jié)之外，HSPHSP另一重要生理功能是對應(yīng)激狀態(tài)下另一重要生理功能是對應(yīng)激狀態(tài)下的細胞提供保護。近年來的研究證實的細胞提供保護。近年來的研究證實HSPHSP蛋白家族的重要蛋白家族

39、的重要成員如成員如HSP90HSP90、HSP70HSP70及及HSP27HSP27等可以直接作用于細胞的抗等可以直接作用于細胞的抗凋亡機制凋亡機制78J Clin Invest. 2005;115(10):26332639.HSP and apoptosis79P53 & apoptosisp53p53主要功能是監(jiān)視細胞基因組主要功能是監(jiān)視細胞基因組DNADNA的完整性。的完整性。 如有損傷，如有損傷，p53p53可以感知這些損傷，可以促使細胞停留在可以感知這些損傷，可以促使細胞停留在G1 G1 期，進行期，進行DNADNA損傷修復(fù)，避免錯誤損傷修復(fù)，避免錯誤DNADNA的進一步復(fù)制

40、。同時，的進一步復(fù)制。同時， p53p53可以促進可以促進DNADNA修復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，從而促進細胞對修復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，從而促進細胞對DNADNA損損 傷進行修復(fù)，確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。傷進行修復(fù)，確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。 一旦這種修復(fù)無法完成，一旦這種修復(fù)無法完成，p53p53將促進一系列凋亡相關(guān)蛋白的表將促進一系列凋亡相關(guān)蛋白的表 達，例如達，例如BaxBax、PUMAPUMA、NoxaNoxa、Fas,Fas,從而有效的誘導(dǎo)細胞凋亡，從而有效的誘導(dǎo)細胞凋亡， 清除受損的細胞，防止細胞癌化清除受損的細胞，防止細胞癌化80A model for p53 regulation 8182ass

41、ociation of TP53 mutations and clinical outcome in selected cancer types83Selected oncogenic properties of mutant p53 and their underlying mechanisms84Interplay of the nuclear and cytoplasmic functions of p53 in apoptosis858687p53 and metabolism. Karen H. Vousden & Kevin M. RyanWhen mutants gain

42、 new powers: news from the mutant p53 field. Ran Brosh & Varda RotterTumour suppression by p53: a role for the DNA damage response? David W. MeekThe expanding universe of p53 targets. Daniel Menendez, Alberto Inga & Michael A. Resnickp53 and E2f: partners in life and death. Shirley Polager &

43、amp; Doron GinsbergThe first 30 years of p53: growing ever more complex. Arnold J. Levine & Moshe Orenp53 ancestry: gazing through an evolutionary. lens Wan-Jin Lu, James F. Amatruda & John M. Abrams88Heiko Hermeking, Cancer Cell, 2007,414-8p53 Enters the MicroRNA World89Suzuki HI, et al. Na

44、ture. 2009 Jul 23;460(7254):529-33.Modulation of microRNA processing by p53P53 WT p53-/- after treatment for 8 or 24 h with 0.2 g ml-1 doxorubicin90Regulation of miRNA biosynthesis by p53Heiko Hermeking, Nature Reviews Cancer 2012, 12, 613-62691Regulation of p53 pathway by miRNA network92Apoptotic s

45、ignalling pathways and the involvement of miRNA regulation93949596細胞凋亡的檢測細胞凋亡的檢測97針對凋亡不同階段特征的檢測方法針對凋亡不同階段特征的檢測方法 1 PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測 細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測 細胞色素C的定位檢測 線粒體膜電位變化的檢測2 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick-end-labeling） LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測) Telemerase Detection

46、(端粒酶檢測) 3 98針對不同位置的凋亡特征的檢測方針對不同位置的凋亡特征的檢測方法法 細胞凋亡的檢測方法凋亡細胞的光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀察凋亡細胞的熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察凋亡細胞的電子顯微鏡觀察相關(guān)凋亡檢測相關(guān)凋亡檢測相關(guān)凋亡檢測Caspase(半胱天冬氨酸酶)活性檢測凋亡相關(guān)的非Caspase蛋白酶檢測胞漿其他蛋白活性檢測相關(guān)凋亡檢測其他99細胞凋亡的檢測方法簡述細胞凋亡的檢測方法簡述 一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測一、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 三、三、 DNADNA片斷化檢測片斷化檢

47、測 四、四、 TUNELTUNEL法法 五、五、 Caspase-3Caspase-3活性的檢測活性的檢測 六、六、 WBWB檢測檢測 100Morphology of Apoptotic Cell凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人肺癌細胞株凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人肺癌細胞株A549A549發(fā)生凋亡，發(fā)生凋亡，hoechst 33258hoechst 33258染色染色101DNA fragmentation and the appearance of “DNA ladder”1021032104105Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI106A

48、nnexin V-FITC FluorescencePI Fluorescence Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium107108109110111112第六節(jié)第六節(jié) 凋亡與自噬凋亡與自噬113Various Models of Cell Death114Nature Immunology 4, 416 - 423 (2003)115Classification of cell death according to caspase activation Necrosis CDCD: Apop

49、tosis, Mitotic Catastrophe, Model of Apoptosis-like, Anoikis CICD: Autophagy, Paraptosis, Oncosis, Model of Necrosis-like116Apoptosis and Autophagy自噬（自噬（autophagyautophagy）：就其本義而言就是自己吃自己，指細胞在營）：就其本義而言就是自己吃自己，指細胞在營養(yǎng)缺乏時靠消化自身細胞器而獲得能量以度過饑荒的行為。然而，養(yǎng)缺乏時靠消化自身細胞器而獲得能量以度過饑荒的行為。然而，在后來的研究中發(fā)現(xiàn)自噬并不只是細胞的一個生存策略，同時也在

50、后來的研究中發(fā)現(xiàn)自噬并不只是細胞的一個生存策略，同時也是細胞死亡的一種方式。如在是細胞死亡的一種方式。如在ParkinsonParkinsons s 和和AlzheimerAlzheimers s 疾病疾病病變的細胞中，經(jīng)常可以看到細胞自噬的現(xiàn)象。病變的細胞中，經(jīng)常可以看到細胞自噬的現(xiàn)象。自噬則是利用溶酶體對細胞自身體內(nèi)的部分細胞質(zhì)和細胞器進行自噬則是利用溶酶體對細胞自身體內(nèi)的部分細胞質(zhì)和細胞器進行一系列降解的過程。它的顯著特征是形成大量自體吞噬小泡。自一系列降解的過程。它的顯著特征是形成大量自體吞噬小泡。自噬過程中的細胞骨架雖然解聚，但并不像凋亡過程那樣發(fā)生明顯噬過程中的細胞骨架雖然解聚，但

51、并不像凋亡過程那樣發(fā)生明顯的細胞骨架降解。的細胞骨架降解。“self-killing” “self-eating”117J Clin Invest. 2005 Oct;115(10):2679-88. 118 自噬現(xiàn)象最早在哺乳動物中的研究是由Ashford和Porten于1962年通過電子顯微鏡在人的肝細胞中觀察到，但直到1997年日本科學(xué)家Yoshinori Ohsumi小組在酵母菌中發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因（autophagy related gene, Atg），對自噬的研究才有新的進展。119誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬的因素：誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬的因素：饑餓、生長因子缺乏、微生物感染、細饑餓、生長因子缺乏

52、、微生物感染、細胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯誤或聚集、胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯誤或聚集、DNADNA損傷、放療、化療等等損傷、放療、化療等等120自噬的特性：自噬的特性：1）自噬是細胞消化掉自身的一部分，初一看似乎對細胞不利。事實上，細胞正常情況）自噬是細胞消化掉自身的一部分，初一看似乎對細胞不利。事實上，細胞正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在。下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在。細胞外的：如外界中的營養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等細胞外的：如外界中的營養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等細胞內(nèi)的：代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)的：代謝壓力、衰老或破損的細胞

53、器、折疊錯誤或聚集的蛋白質(zhì)等由于這些因素的經(jīng)常性存在，因此細胞保持了一種很低的基礎(chǔ)的自噬活性以維持自穩(wěn)。由于這些因素的經(jīng)常性存在，因此細胞保持了一種很低的基礎(chǔ)的自噬活性以維持自穩(wěn)。2）自噬過程很快，被誘導(dǎo)后）自噬過程很快，被誘導(dǎo)后8min即可觀察到自噬體形成，即可觀察到自噬體形成，2h后自噬溶酶體基本降解消后自噬溶酶體基本降解消失。這有利于細胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境。失。這有利于細胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境。3）自噬的可誘導(dǎo)特性：表現(xiàn)在）自噬的可誘導(dǎo)特性：表現(xiàn)在2個方面，第一是自噬相關(guān)蛋白的快速合成，這是準(zhǔn)備階個方面，第一是自噬相關(guān)蛋白的快速合成，這是準(zhǔn)備階段。第二是自噬體的快速大量形成，這是執(zhí)行階段。段。

54、第二是自噬體的快速大量形成，這是執(zhí)行階段。4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別5）自噬的保守性：由于自噬有利于細胞的存活，因此無論是物種間、還是各細胞類型）自噬的保守性：由于自噬有利于細胞的存活，因此無論是物種間、還是各細胞類型之間，自噬都普遍被保留下來。之間，自噬都普遍被保留下來。121122Autophagy pathway and its role in cellular Autophagy pathway and its role in cellular adaptation to nutrient deprivationadapt

55、ation to nutrient deprivationLevine B, Nature. 2007;446(7137):745-7.123Regulation of the Autophagic Pathway124Autophagy in Health and Disease125自噬和腫瘤自噬和腫瘤雙刃劍雙刃劍 與凋亡（在腫瘤細胞中一般都存在缺限）不同，自與凋亡（在腫瘤細胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被優(yōu)先保留的。噬是被優(yōu)先保留的。 自噬基因敲除的動物自發(fā)腫瘤增多，相反自噬基因自噬基因敲除的動物自發(fā)腫瘤增多，相反自噬基因敲除后，增加了化療、放療、免疫治療的敏感性。敲除后，增加了化療、

56、放療、免疫治療的敏感性。126自噬與腫瘤自噬與腫瘤1）腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，對營養(yǎng)和能量的需求比正常細胞）腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，對營養(yǎng)和能量的需求比正常細胞更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長大發(fā)生血管崩塌時、腫瘤細胞脫離原發(fā)灶游走時等都會出現(xiàn)營養(yǎng)腫瘤長大發(fā)生血管崩塌時、腫瘤細胞脫離原發(fā)灶游走時等都會出現(xiàn)營養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷，而此時提高自噬活性可以有助于度過這一危機。不足或供應(yīng)中斷，而此時提高自噬活性可以有助于度過這一危機。2）當(dāng)化療、放療后，腫瘤細胞會產(chǎn)生大量的破損細胞器、損壞

57、的蛋白質(zhì)）當(dāng)化療、放療后，腫瘤細胞會產(chǎn)生大量的破損細胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，而此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)等有害成分，而此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時間和條件。贏得時間和條件。3）由于自噬減少了腫瘤細胞在代謝應(yīng)激時發(fā)生壞死的機會，而對于腫瘤）由于自噬減少了腫瘤細胞在代謝應(yīng)激時發(fā)生壞死的機會，而對于腫瘤細胞群體而言，需要一部分細胞發(fā)生壞死，以引發(fā)適度的炎癥（有利于細胞群體而言，需要一部分細胞發(fā)生壞死，以引發(fā)適度的炎癥（有利于血管的長入、吸引免疫細胞分泌生長因子等）。研究發(fā)現(xiàn)，很多類型的血管的長

58、入、吸引免疫細胞分泌生長因子等）。研究發(fā)現(xiàn)，很多類型的腫瘤在代謝應(yīng)激時會腫瘤在代謝應(yīng)激時會“組成性組成性”活化活化PI3K信號以抑制自噬。信號以抑制自噬。127對不同的細胞，自噬的作用可能不同。對不同的細胞，自噬的作用可能不同。相同的細胞在不同的外部因素作用時，自噬的作用可能不同。相同的細胞在不同的外部因素作用時，自噬的作用可能不同。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，自噬的作用可能不同。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，自噬的作用可能不同。 腫瘤生長的早期階段自噬增強，是由于此時腫瘤的血管化作用不足，癌腫瘤生長的早期階段自噬增強，是由于此時腫瘤的血管化作用不足，癌細胞的營養(yǎng)供給有限，需要通過自噬為自身提供營養(yǎng)。細胞的營養(yǎng)供給有限，需要通過自噬為自身提供營養(yǎng)。 腫瘤進入發(fā)展階段后基因變異積累，使包括腫瘤進入發(fā)展階段后基因變異積累，使包括 Beclin 1在內(nèi)的眾多抑癌在內(nèi)的眾多抑癌基因失活，自噬活力降低。基因失活，自噬活力降低。對單個細胞和對整個腫瘤阻滯的作用可能不同。自噬功能不全的細胞易對單個細胞和對整個腫瘤阻滯的作用可能不同。自噬功能不全的細胞易于壞死，但