1、    RPHPLC法測定小鼠血漿中蒿甲醚的濃度【摘要】  目的 建立測定小鼠血漿中蒿甲醚濃度的 方法 。方法 采用RPHPLC法，色譜柱為Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm,5 m），流動相為甲醇水（體積比8515）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為室溫。利用甲基叔丁基醚對小鼠血漿及組織中蒿甲醚及蒿乙醚進行提取后進行測定。結果 蒿甲醚與蒿乙醚的色譜峰分離良好并且出峰時間相近，以蒿乙醚為內標測定血漿中蒿甲醚符合方法學要求，血漿標準曲線在一定范圍內線性關系良好（R2=0.9991

2、,n=5）,高、中、低3個濃度的回收率均為97%以上，日內及日間RSD均小于3%。結論 建立的方法可簡單快速測定蒿甲醚在小鼠血漿中的濃度，為內標法測定蒿甲醚在動物血漿中的濃度提供思路。 【關鍵詞】  蒿甲醚；蒿乙醚；高效液相色譜法；內標法；血藥濃度Content analysis of artemether in mice plasma by RPHPLCWANG Hao, LI Lijuan, DENG Yingjie(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Chin

3、a)Abstract:Objective To establish a method for determining the contents of artemether and arteether in mice plasma by RPHPLC.Methods Artemether and arteehter in mice plasma were extracted by methyl tertbutyl ether before detection, then analyzed on a Diamonsil C18 column（150 mm×4.6 mm, 5 m）.

4、60; The  mobile phase consisted of methanolwater（8515）. The flow rate was 1.0 mL/min. The wavelength was 210 nm and room temperature was selected for determination of artemether.Results The chromatographic peaks of artemether and arteether were totally separated with similar retention

5、 times at the selected HPLC condition. There was a good linearity for artemether analysis  when  arteether was used as the inner standard (r=0.9991,n=6). The recoveries were all more than 96% during high, middle and low concentration of artemether. RSDs of withindays and betweend

6、ays were all less than 3%.Conclusion The concentration of artemether in plasma could be analyzed easily and rapidly by the established HPLC method.Key words:artemether; arteether; HPLC; inner standard method; blood drug level青蒿素（qinghaosu,QHS）類化合物是我國在90年代初期開發的具有良好抗瘧疾活性的倍半萜類化合物1。其中，青蒿素的脂溶性衍生物蒿甲醚(arte

7、mether,ARM)近年來頗為引人關注，其抗瘧疾效果是青蒿素的10倍2。最近，青蒿素類化合物在抗癌領域也受到越來越廣泛的關注，尤其是在抗非小細胞肺癌及白血病 治療 方面有顯著作用3-4。蒿甲醚的含量測定方法 文獻 報道的有紫外分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法，但這些方法僅限于蒿甲醚制劑含量的測定、體外釋放測定5-6或用于生物樣品含量測定7-8。采用內標法并用高效液相色譜-紫外法測定其在血漿中的含量的方法尚未見文獻報道。蒿乙醚(arteether,ARE)曾被用作抗血吸蟲藥物9，與蒿甲醚結構相似，同為構型雙氫青蒿素的甲基化、乙基化衍生物，化合物的結構見圖1。本文以蒿乙醚為內標物質，采用R

8、PHPLC法測定小鼠血漿中蒿甲醚的濃度。圖1 青蒿素（A）、蒿甲醚（B）、蒿乙醚（C）化學結構圖（略）Fig.1 Structures of arteannuin(A),artemether and arteether (C)1 儀器與試藥 1.1 儀器高效液相色譜儀（LC10ATVP泵，SPD10AVP紫外檢測器，日本島津公司），TGL16 G高速微型臺式離心機（上海醫分儀器制造有限公司），802離心機（金壇市榮華儀器制造有限公司），XW80A渦旋振蕩器（上海精科實業有限公司）。1.2 材料蒿甲醚（上海DESANO公司惠贈，質量分數97%），蒿乙醚（質量分數為99%，以青蒿素為原料經本實驗室

9、合成，青蒿素由上海DESANO公司惠贈），甲醇（色譜純，江蘇漢邦有限公司），純凈水（杭州娃哈哈集團）,甲基叔丁基醚（tertbutyl methyl ether,TBME,國藥試劑集團）。1.3 實驗動物昆明種小白鼠：沈陽藥科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼)2003-008。2 方法與結果 2.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm,5 m,迪馬 科技 有限公司）；流動相：甲醇水（體積比8515）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：室溫30 ;進樣量：20 L。2.2 血漿樣品的處理取昆明種小鼠數只，摘眼球后

10、取血于涂有肝素的小試管內，取離心后的上層血漿250 L于10 mL具塞試管內，分別加入6.32 mg/mL的蒿甲醚甲醇溶液20 L,63.2 mg/mL的蒿甲醚甲醇溶液5 L,15 L。渦旋3 min，再加入5 mL甲基叔丁基醚渦旋3 min,3 500 r/min下離心3 min后取上清液3 mL，氮氣吹干，用甲醇150 L溶解，進樣20 L，記錄峰面積。2.3 方法專屬性從圖2可見，蒿甲醚與蒿乙醚的出峰時間分別為6.5 min和8.28 min,兩種物質的出峰時間相近，并且都能在10 min之前出峰，分離度良好（R=6.14）。2.4 血漿中蒿甲醚含量測定標準曲線的制備取3份250 L小鼠

11、血漿，分別加入6.32 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液10、20、30、40 L和63.2 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液15 L，15.82 mg/mL的內標蒿乙醚20 L，以蒿甲醚與蒿乙醚峰面積的比值為橫坐標，蒿甲醚在小鼠血漿中的濃度為縱坐標作圖得內標法的線性關系曲線，y=243.44x+4.152，R2=0.999 1，線性范圍03.792 mg/mL。A.甲醇溶液中蒿甲醚(ARM)與蒿乙醚(ARE)的色譜圖B.提取后的空白血漿色譜圖C.提取后的空白血漿中添加蒿甲醚與蒿乙醚后的色譜圖D.甲醇溶液中青蒿素(QHS)與蒿甲醚的色譜圖圖2 高效液相色譜圖（略）Fig.2 HPLC chromatogram

12、s2.5 提取回收率按“2.1.2”項下處理血漿樣品后，高、中、低3個濃度的蒿甲醚在小鼠血漿中的提取回收率(n=3)分別為(84.8±1.6)%，(83.5±1.1)%，(73.0±2.9)%。2.6  方法 回收率分別量取250 L小鼠血漿，精密加入6.32 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液15 L,35 L，63.2 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液7 L, 按“2.1.2”項下處理后測定色譜峰面積，代入標準曲線換算成實際測定濃度， 計算 低、中、高3個濃度的回收率（n=3）分別為(98.7±1.3)%(98.2±1.7)%,(96.8

13、±2.1)%。2.7 精密度試驗分別量取250 L小鼠血漿，精密加入6.32 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液15 L,35 L，63.2 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液7 L，按“2.1.2”項下處理，于1 d內和連續3 d重復進樣3次,測得日內RSD分別為1.736%，1.979%，1.085%，日間RSD分別為1.912%，2.031%，1.257%。3 討論 3.1 本 研究 采用蒿甲醚的同系物蒿乙醚為內標物，建立了RPHPLCCOARTEMJ. 中國 藥師，2006，9（10）：965-966.2 王冶，劉昊，黎檀實,等.蒿甲醚和雙氫青蒿素 治療 維和部隊瘧疾93例 分析 J.熱帶醫學雜志，2007，20（1）：42-44.3 郭燕，王俊，章必成，等.蒿甲醚對人肺腺癌A549細胞體外生長的影響J.醫學研究生學報，2007，20（3）：233-239.4 龔峻梅，杜慶鋒，劉曉力.青蒿素及其衍生物的抗白血病作用J.國際輸血及血液學雜志，2007，30（3）：264-266.5 王子幼，陳祖芬.高效液相色譜法測定蒿甲醚膠囊的含量J.藥物分析雜志，2000，20（3）：178-179.6 周琳，張小松.HPLC測定蒿甲醚膠丸的含量J.華西藥學雜志，2005，20（4）：34