1、基因突變的類型（一）基因突變的類型（一）基因缺失基因缺失：地貧、地貧、DMDDMD或或BMDBMD、 變形性骨炎、無精癥變形性骨炎、無精癥診斷方法診斷方法：Southern blotSouthern blot，PCRPCR基因突變的類型（二）基因突變的類型（二）點突變點突變：HbMckees-RockHbMckees-Rock、HbHb Constant Constant Spring Spring、地中海貧血地中海貧血等。等。診斷方法診斷方法：RFLPRFLP、ASOASO雜交、雜交、PCRPCR產(chǎn)物多產(chǎn)物多 態(tài)性分析（態(tài)性分析（RFLPRFLP、SSCPSSCP、DGGEDGGE）印記基因

2、異常印記基因異常： 貝貝-威綜合征（威綜合征（Beckwith-Wiedemann syndrome）; 普普-威綜合征威綜合征（Prader-Willi syndrome）; 安格爾曼綜合安格爾曼綜合征（征（Angelman syndrome）診斷方法診斷方法：等位基因甲基化特異性：等位基因甲基化特異性PCR基因突變的類型（三）基因突變的類型（三）基因異常不明基因異常不明 ：成年型多囊腎病等：成年型多囊腎病等. .診斷方法診斷方法：連鎖的多態(tài)性，如：連鎖的多態(tài)性，如SSCPSSCP、AFLPAFLP連鎖分析，連鎖分析，RFLPRFLP位點單體型連鎖位點單體型連鎖分析分析. .基因突變的類型（

3、四）基因突變的類型（四） 出生缺陷預(yù)防實驗室診斷方法第三章第三章 聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng) 概念：概念：利用利用DNA片段旁側(cè)兩個短的單鏈引物，片段旁側(cè)兩個短的單鏈引物，在熱穩(wěn)定的聚合酶作用下，通過雙鏈在熱穩(wěn)定的聚合酶作用下，通過雙鏈DNA模板的熱模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復循環(huán)，體外快速變性、引物退火和引物延伸的重復循環(huán)，體外快速擴增特異擴增特異DNA片段的技術(shù)。該技術(shù)由片段的技術(shù)。該技術(shù)由Kary Mullis發(fā)發(fā)明，并獲明，并獲1993年度諾貝爾獎。年度諾貝爾獎。（Chapter 2 Polymerase Chain Reaction，PCR）1.PCR1.PCR原理和方法

4、原理和方法 PCR即是在體外模擬即是在體外模擬DNA復制的過程，它用復制的過程，它用加熱的辦法讓所研究的加熱的辦法讓所研究的DNA片段變性變成兩條單片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引物讓它們結(jié)合到鏈，人工合成兩個引物讓它們結(jié)合到DNA模板的模板的兩端，兩端，DNA聚合酶即可以大量復制該模板。聚合酶即可以大量復制該模板。假定我們要研究的假定我們要研究的DNADNA雙鏈兩端的序列是：雙鏈兩端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA使

5、用材料：使用材料：引物引物F: ataagcccgaaaggttcgtt引物引物R: tttacggatcggcaacctatDNA模板模板DNA聚合酶（聚合酶（Taq）底物（四種脫氧核苷）底物（四種脫氧核苷）55334.PCR4.PCR的的PBDPBD中的應(yīng)用中的應(yīng)用 建立于建立于PCRPCR技術(shù)基礎(chǔ)上的突變基因檢測技術(shù)發(fā)技術(shù)基礎(chǔ)上的突變基因檢測技術(shù)發(fā)展迅速，它不僅能在短時間內(nèi)檢出發(fā)生突變的基因，展迅速，它不僅能在短時間內(nèi)檢出發(fā)生突變的基因，而且即使獲得極微量的組織亦可經(jīng)而且即使獲得極微量的組織亦可經(jīng)PCRPCR擴增而進行擴增而進行各種檢測，加上各種檢測，加上PCRPCR技術(shù)與分子雜交、技術(shù)

6、與分子雜交、SSCPSSCP、DDGGEDDGGE、RFLPRFLP及直接測序等技術(shù)的結(jié)合，大大的促進了出生及直接測序等技術(shù)的結(jié)合，大大的促進了出生缺陷預(yù)防（缺陷預(yù)防（Prevention of birth defectsPrevention of birth defects，PBDPBD）的研究。的研究。（1） Gap-PCR 應(yīng)用條件：應(yīng)用條件：基因的基因的DNA序列已經(jīng)清序列已經(jīng)清楚，其楚，其缺失缺失部位亦較為固定。部位亦較為固定。舉例舉例1，-地貧：地貧：中國人中常見的缺失型中國人中常見的缺失型地貧基因為地貧基因為-SEA、-3.7和和-4.2 。 2 1 2 1 2 1-SEA-3.

7、7-4.253 2 1 2 1 2 153 U M D D U-SEA53 2 1 2 2 1 2 1 2 1-SEA-3.7-4.253P1P2P3P4(2) (2) 等位基因特性等位基因特性PCRPCR（allele-specific pcr,ASPCR）應(yīng)用條件：應(yīng)用條件：基因的基因的DNA序列已經(jīng)清序列已經(jīng)清楚，其突變性質(zhì)為楚，其突變性質(zhì)為點突變點突變。ASPCR:也稱為擴增阻礙突變系統(tǒng)也稱為擴增阻礙突變系統(tǒng) (amplification refractory mutation system,ARMS)ASPCR原理：原理： PCR反應(yīng)中反應(yīng)中DNA合成是根據(jù)堿基互補原則來獲合成是根據(jù)

8、堿基互補原則來獲得相同的得相同的DNA片段的，有時引物與模板的單個堿片段的，有時引物與模板的單個堿基存在差異時，多聚酶鏈反應(yīng)仍能進行，但當基存在差異時，多聚酶鏈反應(yīng)仍能進行，但當3末末端兩個并列堿基其中之一與模板不互補端兩個并列堿基其中之一與模板不互補(錯配錯配)時，時，PCR就會因磷脂鍵形成困難而受阻則無反應(yīng)發(fā)生。就會因磷脂鍵形成困難而受阻則無反應(yīng)發(fā)生。ASPCRASPCR引物設(shè)計引物設(shè)計： 通過設(shè)計兩個通過設(shè)計兩個5端引物，一個與正常端引物，一個與正常DNA互補，互補，一個與突變一個與突變DNA 互補，對于純合型突變，分別加互補，對于純合型突變，分別加入這兩種引物及入這兩種引物及3端引物進

9、行兩個平行端引物進行兩個平行PCR，只有，只有與突變與突變DNA 完互補的引物才可延伸并得到完互補的引物才可延伸并得到PCR 擴擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3端第一或第二個堿端第一或第二個堿基，則導致基，則導致PCR 不能延伸。不能延伸。M 1 2 3 455353335（signle strand conformation polymorphism,SSCP） （3 3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性）單鏈構(gòu)象多態(tài)性 概念概念：單鏈單鏈DNADNA由于堿基序列的不同可引由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈的單鏈

10、DNADNA電泳遷移率不同，從而可用于電泳遷移率不同，從而可用于DNADNA中單個堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測。中單個堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測。 應(yīng)用條件：應(yīng)用條件：單堿基替代、微小缺失或插入。單堿基替代、微小缺失或插入。可檢測未知突變。需測序確認突變。可檢測未知突變。需測序確認突變。PCR-SSCP分析法適用于致病基因內(nèi)尚未明確的點突變，可將檢測范圍縮小至某一外顯子或某一片段，再對外顯子或片段進行測序即可確定突變位點。解鏈構(gòu)像DAN原原 理理1 2 3 4 5過過 程程 實例實例1 1鐮鐮 型型 細細 胞胞 貧貧 血血 癥癥實例實例2 2 多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征

11、 Cowden Syndrome CowdenCowden綜合征（綜合征（CSCS）是一種常染色體顯性遺傳病，）是一種常染色體顯性遺傳病，特征是形成多發(fā)性錯構(gòu)瘤，累及所有源自特征是形成多發(fā)性錯構(gòu)瘤，累及所有源自3 3個胚層的器官。個胚層的器官。合并合并CowdenCowden綜合征的經(jīng)典錯構(gòu)瘤是毛鞘瘤。患病的家族綜合征的經(jīng)典錯構(gòu)瘤是毛鞘瘤。患病的家族成員具有發(fā)展成乳腺癌和非髓性甲狀腺癌的高級別危險。成員具有發(fā)展成乳腺癌和非髓性甲狀腺癌的高級別危險。臨床表現(xiàn)還包括黏膜上皮病變、甲狀腺異常、乳腺纖維臨床表現(xiàn)還包括黏膜上皮病變、甲狀腺異常、乳腺纖維囊性病變、胃腸道錯構(gòu)瘤、早年就發(fā)病的子宮平滑肌瘤、囊

12、性病變、胃腸道錯構(gòu)瘤、早年就發(fā)病的子宮平滑肌瘤、大頭畸形、智力低下以及小腦發(fā)育不良性神經(jīng)節(jié)細胞瘤大頭畸形、智力低下以及小腦發(fā)育不良性神經(jīng)節(jié)細胞瘤（LhermitteLhermitteDuclosDuclos）。該綜合征是由）。該綜合征是由PTEN/MMAC1PTEN/MMAC1基因基因突變引起的。突變引起的。PTEN 外顯子外顯子5 (R130X)新發(fā)點突變新發(fā)點突變. PTEN 外顯子外顯子7 (Q214X) 點突變點突變 ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE) (4) (4) 變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳 原理：原理：電泳開始時電

13、泳開始時,DNA,DNA在膠中的遷移速率僅與在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān)分子大小有關(guān), , 而一旦而一旦DNADNA泳動到某一點時泳動到某一點時, , 即即到達該到達該DNADNA變性濃度位置時變性濃度位置時, , 使得使得DNADNA雙鏈開始分雙鏈開始分開開, ,從而大大降低了遷移速率。由于不同的從而大大降低了遷移速率。由于不同的DNA DNA 片段的堿基組成有差異片段的堿基組成有差異, , 使得其變性條件產(chǎn)生差使得其變性條件產(chǎn)生差異異, , 從而在凝膠上形成不同的條帶。從而在凝膠上形成不同的條帶。應(yīng)用條件：應(yīng)用條件：與與PCR-SSCP相似相似DGGE原理圖原理圖恒定變性凝膠電泳(CD

14、GE)瞬時溫度梯度電泳(TTGE)溫度梯度凝膠電泳(TGGE)此外類似的實驗方法還有：(5) (5) 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）概念：概念：當基因突變涉及到限制酶識別位當基因突變涉及到限制酶識別位點時，限制性內(nèi)切酶可將點時，限制性內(nèi)切酶可將DNADNA切成長度切成長度不同的片段，從而在人群中形成多種類不同的片段，從而在人群中形成多種類型故稱為限制性片段長度多態(tài)性。型故稱為限制性片段長度多態(tài)性。 應(yīng)用條件：應(yīng)用條件：當基因突變涉及到限制酶識當基因突變涉及到限制酶識別位點時。別位點時。Al

15、lele IIAllele II12Kb8Kb4Kbprobeprobe12Kb8Kb RFLPRFLPSouthern blotSouthern blot檢測結(jié)果檢測結(jié)果 實例1 實例 2 長 QT間期綜合征 LQTS多數(shù)由單多數(shù)由單個氨基酸置換引個氨基酸置換引起，本系譜顯示起，本系譜顯示的是的是HERG 基因基因371 位置位置TC 置置換換,PCR產(chǎn)物采用產(chǎn)物采用AccII酶解后酶解后,產(chǎn)產(chǎn)生生138 bp 片斷。片斷。(methylation specofic PCR, MS-PCR)(6)(6) 甲基化特性甲基化特性PCR孟德爾定律不能解釋的遺傳現(xiàn)象：孟德爾定律不能解釋的遺傳現(xiàn)象：某

16、個子女的一個特征長得像父親而某個子女的一個特征長得像父親而 另一個子女的同一特征則長得像其母，另一個子女的同一特征則長得像其母， 而不是表現(xiàn)父母同一性狀的平均值。而不是表現(xiàn)父母同一性狀的平均值。公驢和母馬所產(chǎn)后代稱為馬騾（公驢和母馬所產(chǎn)后代稱為馬騾（mule）；）； 公馬和母驢所產(chǎn)后代稱為驢騾（公馬和母驢所產(chǎn)后代稱為驢騾（hinny）。）。基因組印記基因組印記(genomic imprinting)(genomic imprinting)：又稱遺傳印：又稱遺傳印記。在哺乳類動物、低等動物和植物中，有些基記。在哺乳類動物、低等動物和植物中，有些基因不是對等表達，而是只選擇性地表達來源于父因不是對

17、等表達，而是只選擇性地表達來源于父或母一方基因。這種現(xiàn)象稱為基因組印記。或母一方基因。這種現(xiàn)象稱為基因組印記。印記基因：印記基因：受到印記控制的基因稱為印記基因。受到印記控制的基因稱為印記基因。印記基因的功能：印記基因的功能：印記的基因只占人類基印記的基因只占人類基因組中的少數(shù)，可能不超過因組中的少數(shù)，可能不超過5%5%，但在胎兒，但在胎兒的生長和行為發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。的生長和行為發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。基因組印記病主要表現(xiàn)為過度生長、生長基因組印記病主要表現(xiàn)為過度生長、生長遲緩、智力障礙、行為異常。遲緩、智力障礙、行為異常。遺傳印記的發(fā)現(xiàn)遺傳印記的發(fā)現(xiàn) 19811981年年Catt

18、anachCattanach等發(fā)現(xiàn)具有兩條等發(fā)現(xiàn)具有兩條母源的母源的1111號染色體的小鼠在胚胎期要號染色體的小鼠在胚胎期要比正常小鼠小比正常小鼠小, ,而具有兩條父源的第而具有兩條父源的第1111號染色體的小鼠在胚胎期比正常小號染色體的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。這兩種小鼠雖然能進行胚胎發(fā)鼠大。這兩種小鼠雖然能進行胚胎發(fā)育育, ,但是均死于胚胎發(fā)育階段。但是均死于胚胎發(fā)育階段。 1984年年McCrath等人用人工單性繁等人用人工單性繁殖殖(孤雌或孤雄生殖孤雌或孤雄生殖)的方法產(chǎn)生了兩種的方法產(chǎn)生了兩種特殊類型的小鼠胚胎，即一種小鼠胚胎特殊類型的小鼠胚胎，即一種小鼠胚胎的全套染色體來自父源，另

19、一種小鼠胚的全套染色體來自父源，另一種小鼠胚胎的全套染色體來自母源。這兩類小鼠胎的全套染色體來自母源。這兩類小鼠均在發(fā)育期死亡。均在發(fā)育期死亡。 1991 1991年年DechiaraDechiara等人通過基因剔除技等人通過基因剔除技術(shù)破壞小鼠胰島素樣生長因子術(shù)破壞小鼠胰島素樣生長因子IGF2IGF2基因發(fā)基因發(fā)現(xiàn)了第現(xiàn)了第1 1個內(nèi)源性印記基因。若被剔除的個內(nèi)源性印記基因。若被剔除的等位基因源于父本，則動物表現(xiàn)為侏儒。等位基因源于父本，則動物表現(xiàn)為侏儒。相反如為母源則無特殊表型，這些本身剔相反如為母源則無特殊表型，這些本身剔除了等位基因的雌鼠，其子代大小正常。除了等位基因的雌鼠，其子代大小

20、正常。實驗表明實驗表明IGF2IGF2被印記而且僅父源等位基因被印記而且僅父源等位基因正常表達。正常表達。印記的過程印記的過程印記形成印記形成印記維持印記維持印記去除印記去除差異差異DNADNA甲基化甲基化 Differential DNA methylation染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑 Chromatin remodeling非編碼非編碼RNARNA Non coding RNA基因印記產(chǎn)生的機制基因印記產(chǎn)生的機制：差異甲基化差異甲基化lthe promoter for IGF2r transcription is methylated (and inactive), lbut the down

21、stream promoter is unmethylated and active. lTranscription of the antisense strand from the downstream promoter produces an ansense RNA that may participate in shutting his gene down. Significant DNA methylation changes are indicated as thick red and green blocks in the ideograms. The 50-year-old tw

22、in pair shows abundant changes in the pattern of DNA methylation (green=hypermethylation and red=hypomethylation), 3-year-old twins have a very similar DNA methylation (yellow). 染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑Acetylation and deacetylation 非編碼非編碼RNARNAlthe promoter for IGF2r transcription is methylated (and inactive), lb

23、ut the downstream promoter is unmethylated and active. lTranscription of the antisense strand from the downstream promoter produces an ansense RNA that may participate in shutting his gene down. (1)(1) 呈簇排列呈簇排列印記基因的特點：(2) 都有一個或幾個印記中心都有一個或幾個印記中心(IC)，即差，即差 異甲基化區(qū)異甲基化區(qū)(DMR)(3) DMR內(nèi)，有富含內(nèi)，有富含CpG的的CpG島島(4)

24、 基因印記可以逆轉(zhuǎn)的基因印記可以逆轉(zhuǎn)的Beckwith-Wiedemann syndrome, BWSPrader-Willi syndromeAngelman syndrome印記基因異常導致的疾病印記基因異常導致的疾病 癥狀巨大舌、臍膨出和生長過剩是BWS的3大主要特征，其它的特征還有出生時的低血糖、內(nèi)臟腫大(主要為肝、腎、脾的腫大)、單側(cè)肥大(身體的一側(cè)生長過剩) 耳垂的線狀凹陷、腎上腺皮質(zhì)細胞腫大和腎髓質(zhì)生長異常等等。約30%的患兒伴有出生時低血糖，可致神經(jīng)障礙。隨著年齡的增長癥狀變得不明顯，致年長兒和成人的診斷困難。另外，約10% BWS患者伴胎兒性腫瘤，其中5O-60% 為Wilm

25、s瘤。 15% 為腎上腺腫瘤其它還有腎母細胞癌、肝母細胞瘤等。BWS臨床癥狀 發(fā)病率約發(fā)病率約0.07 0.07 ，無性別差異，無性別差異，85%85%為為散在發(fā)病，散在發(fā)病，l5%l5%為家族性遺傳，符合常染色體為家族性遺傳，符合常染色體顯性遺傳。同一家族內(nèi)患者的臨床表現(xiàn)差異顯性遺傳。同一家族內(nèi)患者的臨床表現(xiàn)差異很大。家族性遺傳為母親單側(cè)遺傳，顯示其很大。家族性遺傳為母親單側(cè)遺傳，顯示其發(fā)病與基因組印記有關(guān)。發(fā)病與基因組印記有關(guān)。遺傳特點：遺傳特點：病因?qū)W細胞遺傳學水平：在散在發(fā)病患者，有l(wèi)lp15重復或雙體型、三體型、平衡易位和倒位等染色體異常的報道，其中11p15的重復和三體型的多余部分

26、均來自父親，11p15附近有切斷點的平衡易位和倒位等均來自母親。基因水平：BWS基因存在區(qū)域11p15.5，。迄今為止在這個基因組區(qū)已克隆了10多個印記基因和非印記基因。BWS和這個區(qū)域的印記基因p57變異、IGF2H19轉(zhuǎn)錄異常、染色體易位(倒位)及LIT1基因上游CpG島的甲基化有關(guān)。Prader-Willi/ /Angelman綜合征綜合征 PWS(MIM176270)的特點為：胎動減少，的特點為：胎動減少，肥胖，嬰兒期肌張力減退，智力障礙，身材短肥胖，嬰兒期肌張力減退，智力障礙，身材短小，促性腺激素分泌不足的性腺機能減退和手小，促性腺激素分泌不足的性腺機能減退和手足異常。足異常。 PW

27、S和和AS是兩種臨床上明顯不同的神經(jīng)是兩種臨床上明顯不同的神經(jīng)遺傳性疾病。遺傳性疾病。鬢角鼻梁窄杏仁型眼睛/輕度斜視上唇薄/下唇上抿超重 AS(MIM105830)的特點是嚴重運動、智力障的特點是嚴重運動、智力障礙，共濟失調(diào)，肌張力低下，癲癇，語言障礙和以礙，共濟失調(diào)，肌張力低下，癲癇，語言障礙和以巨大下頜及張口吐舌為特征的特殊面容。巨大下頜及張口吐舌為特征的特殊面容。Bower和和Jeavons于于1967年創(chuàng)造了名為愉快木偶綜合征年創(chuàng)造了名為愉快木偶綜合征(AS)的疾病，稱的疾病，稱“安琪兒安琪兒”(Angelman)。PWS和和AS均均為染色體為染色體15q11-13缺陷，其發(fā)病率約為缺

28、陷，其發(fā)病率約為1/15 000 。PWS和和AS的分子缺陷類別的分子缺陷類別（1）缺失）缺失約70%的PWS及AS患者均發(fā)現(xiàn)有染色體15q11-13的缺失。PWS為父源染色體15q11-13的缺失、母源基因不表達，而AS為其母源染色體15q11-13的缺失、父源基因不表達。（2）單親二體）單親二體(uniparental disomy, UPD) PWS和AS患者的兩條15號染色體均正常，但PWS患者的兩條15號染色體均來自母親，即母親單親二體(UPD)；而AS患者的兩條15號染色體均來自父親，即父親單親二體(UPD)。PWS的UPD發(fā)生率較普遍(25%)，而AS的較低(2%)。 （3）印跡

29、突變 世代傳遞過程中，由于控制印跡的基因發(fā)生突變導致在世代傳遞過程中，由于控制印跡的基因發(fā)生突變導致在配子形成中發(fā)生重新設(shè)定和轉(zhuǎn)換失敗。約配子形成中發(fā)生重新設(shè)定和轉(zhuǎn)換失敗。約5%的的PWS和和AS患患者雖然從雙親各遺傳了者雖然從雙親各遺傳了1條條15號染色體，但是它們在印跡的號染色體，但是它們在印跡的染色體染色體15q11-13區(qū)域呈現(xiàn)異常區(qū)域呈現(xiàn)異常DNA的甲基化和基因表達，提的甲基化和基因表達，提示這類患者在自身的印跡過程中發(fā)生了突變。其中的一半示這類患者在自身的印跡過程中發(fā)生了突變。其中的一半(包括家族性的包括家族性的)為微缺失，為微缺失，PWS缺失的共同最小區(qū)域在缺失的共同最小區(qū)域在SNRPN基因的第基因的第1外顯子外顯子(4kb)，而，而AS在在SNRPN基因的第基因的第1外顯子的上游外顯子的上游(2kb)，從而確定這類患者為印跡中心，從而確定這類患者為印跡中心