1、第一節：氨基酸，第一節：氨基酸，2.5學時學時第二節：氨基酸的分離分析，第二節：氨基酸的分離分析，0.5學時學時第三節：肽和蛋白質，第三節：肽和蛋白質，0.5學時學時第四節：蛋白的分離，第四節：蛋白的分離，0.5學時學時第五節：一級結構測定，第五節：一級結構測定，1學時學時蛋白質種類與功能的多樣性蛋白質種類與功能的多樣性 1010-1012結構蛋白貯藏蛋白收縮蛋白轉運蛋白l180180多種天然多種天然AAAA，大多數是不參與蛋白質組，大多數是不參與蛋白質組成的。這些成的。這些AAAA被稱為非蛋白質被稱為非蛋白質AAAA。l參與蛋白質組成的參與蛋白質組成的AAAA為為蛋白質蛋白質AAAA，常見的

2、常見的只有只有2020種種 基本氨基酸，標準氨基酸基本氨基酸，標準氨基酸l 表達方式：表達方式：三字母三字母或或單字母的簡寫符號單字母的簡寫符號l除脯氨酸外，其他除脯氨酸外，其他1919種均具有如下結構通式。種均具有如下結構通式。各種氨基酸的區別在于側鏈各種氨基酸的區別在于側鏈R R基基的不同。的不同。 -氨基酸氨基酸可變部分可變部分不變部分不變部分COOHCHH2NR一、基本氨基酸1, 1, 按按側鏈側鏈R R基的化學結構基的化學結構，分為三類，分為三類l脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸15種種C2:1 C3:3 C4:3 C5:4 C6:4l芳香族氨基酸芳香族氨基酸3種種l雜環族氨基酸雜環族氨基酸

3、2種種GlyAlaValLeuIlePheTyrTrpCysMetSS氨基酸氨基酸的的R R基大小基大小l分為分為4 4類：類：l非極性氨基酸：非極性氨基酸：9 9l 極性不解離：極性不解離：6 6l極性氨基酸極性氨基酸 解離帶負電荷：解離帶負電荷：2 2酸性酸性l 極性解離極性解離l 解離帶正電荷：解離帶正電荷：3 3堿性堿性lPOLARNON-POLARTyrHisGly酸性酸性中性中性BasicAspGluGlnCysAsn SerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸的極性分類氨基酸的極性分類極極性或非性或非極極性，是性，是影響影響蛋白蛋白質結構與性質

4、的關鍵質結構與性質的關鍵-+SS有大有小有正有負有極性非極性 形形色色的氨基酸側基 l含硫氨基酸含硫氨基酸l含羥基氨基酸含羥基氨基酸l-C-C帶分支氨基酸帶分支氨基酸l二羧基一氨基氨基酸二羧基一氨基氨基酸l二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸l亞氨基酸亞氨基酸COOHCHH2NR除甘氨酸外，除甘氨酸外，皆含皆含手性手性C C，皆為，皆為L-L-構型（構型（蛋白中的蛋白中的氨氨基酸）；基酸）；旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測定。旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測定。比旋光度比旋光度D D2525( (單位濃度、單位長度下的旋光度，單位濃度、單位長度下的旋光度，/c/c* *l)l)是氨基酸的重要物

5、理常數之一，是鑒別各種是氨基酸的重要物理常數之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據氨基酸的重要依據 。l在近紫外區在近紫外區(200-400nm)(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能和色氨酸有吸收光的能力。力。l酪氨酸酪氨酸的的 maxmax275nm275nm，l色氨酸色氨酸的的 maxmax280nm280nml苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nml一）氨基酸的兼性離子形式：一）氨基酸的兼性離子形式： 氨基酸的兩個重要性質：氨基酸晶體的氨基酸的兩個重要性質：氨基酸晶體的熔點高（熔點高（ 200200 C C）；氨基酸使水的介電）；氨

6、基酸使水的介電常數增高。常數增高。 AA是兩性電解質COOHNH2 H+COO-R - C - HNH2 H+R - C - HCOO-NH2R - C - H酸性環境酸性環境中性中性環境環境堿性環境堿性環境+1-10pK1 2pK2 9.4等電點等電點6.0等等電點電點pIpI：所帶凈電荷為零。電場中不移動。：所帶凈電荷為零。電場中不移動。此此氨基酸氨基酸在在 pH pH 2 2 或或 9 9 附近，有附近，有緩沖緩沖作用作用。賴氨酸的解離及等電點計算賴氨酸的解離及等電點計算HA2+A+A0A-l等電點等電點(isoelectric point,pI)(isoelectric point,p

7、I)：l中性氨基酸：酸性和堿性基團的算術平均值：中性氨基酸：酸性和堿性基團的算術平均值： p pI I = (p = (pK K-COO-COO- + p- + pK K-NH2 -NH2 )/2)/2， l l酸性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術平均值酸性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術平均值p pI I = (p = (pK K-COO-COO- + p- + pK KR-COOR-COO- - )/2 )/2 ， l堿性氨基酸：兩個堿性解離基團的算術平均值堿性氨基酸：兩個堿性解離基團的算術平均值p pI I = (p = (pK K-NH2-NH2+ p+ pK KR-NH2 R-NH2 )

8、/2 )/2 ， COOHCHH2NR亞硝酸反應亞硝酸反應烴基化反應烴基化反應酰化反應酰化反應脫氨基反應脫氨基反應西佛堿反應西佛堿反應成鹽成酯反應成鹽成酯反應成酰氯反應成酰氯反應脫羧基反應脫羧基反應疊氮反應疊氮反應側鏈反應側鏈反應茚三酮反應茚三酮反應成成 肽肽 反反 應應用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。CCCOOO茚三酮茚三酮CCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮水合茚三酮CO2NH2RCHO+CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2+CCCOOOCCCOOHHOl氨基酸的結構通式為氨基酸的

9、結構通式為氨基酸。蛋白質氨基酸。蛋白質除含除含C,H,OC,H,O外，還含有外，還含有N N。AAAA平均分子量平均分子量為為110110。l不同蛋白的含氮量皆在不同蛋白的含氮量皆在16%16%左右。只需測左右。只需測定定N N含量，含量， N N含量含量/16%/16%即為蛋白含量。即為蛋白含量。l l - -凱氏定氮法的理論基礎凱氏定氮法的理論基礎l根據根據R R基的極性。原理：分配層析。基的極性。原理：分配層析。l 濾紙層析濾紙層析：l 薄層層析薄層層析：l根據氨基酸的凈電荷及根據氨基酸的凈電荷及R R基的極性：基的極性：l 離子交換層析離子交換層析：l陰離子交換樹脂-N(CH3)3OH

10、，陽離子交換樹脂-SO3Hl根據氨基酸的凈電荷及質點大?。焊鶕被岬膬綦姾杉百|點大?。簂 電泳電泳：l層析法層析法色層分析法（色譜）色層分析法（色譜）系統的組成固定相（靜相）系統的組成固定相（靜相）流動相（動相）流動相（動相）l分配定律分配定律當溶質在兩種給定的當溶質在兩種給定的互不相互不相溶溶的溶劑中分配時，在一定的溫度下達到的溶劑中分配時，在一定的溫度下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比值為一常平衡后，溶質在兩相中的濃度比值為一常數數. .此比值即分配系數（此比值即分配系數（kdkd）。）。l 固定相：固定相：纖維素上吸附的水纖維素上吸附的水流動相：展層溶劑，有機相流動相：展層溶劑，有機相

11、層析時，混合層析時，混合AAAA在兩相中不斷分配，在兩相中不斷分配，疏水性強的疏水性強的AAAA在固定相水中溶解度在固定相水中溶解度較較小，與水的作用力也較小，與水的作用力也較小，小，隨展層劑的展層（移動）也移動較遠距離隨展層劑的展層（移動）也移動較遠距離（遷移率（遷移率RfRf大）。大）。l極性強的極性強的RfRf值小，疏水性強的值小，疏水性強的RfRf大。大。l分離、鑒定分離、鑒定AAAA混合物的方法。混合物的方法。l將下列每組混合物分別用正丁醇將下列每組混合物分別用正丁醇- -醋酸醋酸- -水進行紙層析，指出每組的相對遷移率。水進行紙層析，指出每組的相對遷移率。l(1) Val(1) V

12、al和和Lys;Lys;l(2) Phe(2) Phe和和Ser;Ser;l(3) Leu(3) Leu、AlaAla、SerSerl一個氨基酸的羧基一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的與另一個氨基酸的氨基之間失水形成氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為的酰胺鍵稱為肽鍵肽鍵，所形成的化合物稱所形成的化合物稱為肽。為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基氨基酸殘基。CCNCCNCCN

13、CCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽鍵l在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。順序稱為氨基酸順序。l方向性：方向性：一條多肽鏈有兩個末端，自由 - -氨基，稱為氨基，稱為氨基端或氨基端或N-N-端；端；游離 - -羧基，稱為羧基端或羧基，稱為羧基端或C-C-端。端。l氨基酸的順序：氨基酸的順序：N-N-端端C-C-端端l如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Glun 絲氨絲氨酰酰纈氨纈氨

14、酰酰酪氨酪氨酰酰天冬氨天冬氨酰酰谷氨谷氨酸酸肽單位肽單位主鏈：側鏈 肽具有酸堿兩性性質和等電點。肽具有酸堿兩性性質和等電點。肽的酸肽的酸堿性質主要來自游離末端堿性質主要來自游離末端 -NH-NH2 2和游離和游離末端末端 -COOH-COOH以及側鏈以及側鏈R R上可解離的基上可解離的基團。每一種肽都有其相應的等電點。團。每一種肽都有其相應的等電點。末末端端 - -NHNH2,2, - -COOHCOOH比游離氨基酸的比游離氨基酸的酸堿度降低。酸堿度降低。 l在生物體中，多肽最重要的存在形式是在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。作為蛋白質的亞單位。l但是，也有許多分子量比較小

15、的多肽以但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態存在。這類多肽通常都具有特游離狀態存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。殊的生理功能，常稱為活性肽。l如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；肽；谷胱甘肽谷胱甘肽；蛇毒多肽等。；蛇毒多肽等。l部分肽中含有部分肽中含有D-D-氨基酸。氨基酸。l CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCHCH2 2SHSH 1.參與體內氧化還原反應參與體內氧化還原反應 2.作為輔酶參與氧化還原反應作為輔酶參與氧化還原反應 保護巰基酶或含保護巰基

16、酶或含Cys的蛋白質中的蛋白質中 SH的還原性的還原性 防止氧化物積累防止氧化物積累GSH+GSH-GSSG根據：根據：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它蛋白（雜蛋白）的不同進行分離。蛋白（雜蛋白）的不同進行分離。 溶解度不同溶解度不同: : 反相柱層析；反相柱層析；鹽析鹽析 分子量不同分子量不同: : 透析；透析；凝膠過濾法凝膠過濾法 所帶電荷不同所帶電荷不同: : 電泳；離子交換層析電泳；離子交換層析 特有的親和力：特有的親和力：親和層析親和層析l不同的蛋白質溶解度不同。且溶解度隨外不同的蛋白質溶解度不同。且溶解度隨外界條件如鹽濃度，界條件如鹽濃度，pHpH值

17、，溫度等而變。值，溫度等而變。 鹽對蛋白質濃度的影響 鹽溶鹽溶 Salting-in:加少量鹽使蛋白質溶解度變大 鹽析鹽析 Salting-out: 加大量鹽使蛋白質由溶液中沉淀出來 蛋白質蛋白質溶解度溶解度和和pH值及鹽濃度有關值及鹽濃度有關0.0010.0050.01 0.02 NaCl(mol/L)pI4.8 5.0 5.2 5.4 5.6pH溶解度蛋白的穩定因素：蛋白的穩定因素：（1 1）帶電層）帶電層（2 2）水化層）水化層加入少量鹽：增加入少量鹽：增加帶電層，促進加帶電層，促進溶解。溶解。 -鹽溶鹽溶Aggregate蛋白質蛋白質分子表面的疏水性分子表面的疏水性區域區域，聚集許多水

18、分子，聚集許多水分子，當當加入加入鹽時鹽時，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水性性區域區域互相互相結合結合，形成，形成沉淀沉淀。 鹽析鹽析 Salting-out Salting-out ：Ionic strength溶解度+-+-+AmmoniumsulfateSodiumsulfateA little salting-in effectNH4+SO42-= hydrophobic硫酸銨分級沉淀硫酸銨分級沉淀l又稱為分子篩層析。依蛋白質分子量的差異，又稱為分子篩層析。依蛋白質分子量的差異，通過具有通過具有分子篩性質的凝膠分子篩性質的凝膠而分離。而分離。l葡聚糖

19、凝膠葡聚糖凝膠G10-G200G10-G200l瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2B,4B,6B2B,4B,6Bl聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠S100S100S600S600 凝膠顆粒小分子進入凝小分子進入凝膠分子內，被膠分子內，被滯留滯留大分子在凝大分子在凝膠顆粒間移膠顆粒間移動，較快流動，較快流出出溶劑流動方向溶劑流動方向按按分分子子量量從從大大到到小小依依次次流流出出l如兩分子間有如兩分子間有專一性親和力專一性親和力（特別的結（特別的結合和識別能力，具有合和識別能力，具有針對性針對性），以其中一種以其中一種作為作為“魚餌魚餌”，可把另外一種，可把另外一種“釣釣”出來。出來。其它蛋白不被吸引而結合不上

20、。其它蛋白不被吸引而結合不上。 親和層析親和層析法的作用法的作用機理機理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團的配體XBAAl在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。相反的電極移動，這種現象稱為電泳。l蛋白質有各自的等電點。在非等電點時，蛋蛋白質有各自的等電點。在非等電點時，蛋白質顆粒均帶有不同的電荷。白質顆粒均帶有不同的電荷。l蛋白質顆粒在電場中移動的速度（蛋白質顆粒在電場中移動的速度（v v）取決于）取決于電場強度電場強度(E)(E)，所帶的，所帶的凈電荷凈電荷(q)(q)以

21、及與以及與介質介質的摩擦系數的摩擦系數(f(f，即顆粒大小及形狀，即顆粒大小及形狀) )。lSDSSDS（十二烷基（十二烷基磺酸鈉磺酸鈉）是一種陰離子型表）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質中的氨基酸殘面活性劑，它能夠與蛋白質中的氨基酸殘基按大約基按大約1 1 2 2比例結合，使比例結合，使蛋白以一條無蛋白以一條無構型的長條分子存在構型的長條分子存在，且分子表面均勻結，且分子表面均勻結合一層負的合一層負的SDSSDS的電荷，蛋白質分子的電荷，蛋白質分子原有電原有電荷間的差別則可以忽略荷間的差別則可以忽略。l用已知分子量的蛋白質作為標準，則可以用已知分子量的蛋白質作為標準，則可以估算出不同

22、蛋白質的分子量。估算出不同蛋白質的分子量。 定義定義 1969年年，國際純化學與，國際純化學與應用化學委員會應用化學委員會（IUPAC） 規定規定：蛋白質的一級：蛋白質的一級結構指結構指蛋白質多蛋白質多肽連中肽連中AA的排列的排列順序，包括二硫順序，包括二硫鍵的位置。鍵的位置。F. Sanger (1953, Cambridge U) Insulin 胰島素 (A, B chains)以傳統氨基酸定序法決定蛋白質序列S SSSS S+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSI C SLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-ch

23、ainl（1） 測定多肽鏈的數目，拆分多肽鏈，測定多肽鏈的數目，拆分多肽鏈，分析分析多肽鏈的多肽鏈的N末端和末端和C末端殘基末端殘基l（2）斷裂多肽鏈內、間的二硫鍵）斷裂多肽鏈內、間的二硫鍵l（3） 測定每條多肽鏈的測定每條多肽鏈的AA組成組成l（4） 多肽鏈斷裂成小肽段多肽鏈斷裂成小肽段 （5） 測定各個肽段的測定各個肽段的AA順序順序 l（6） 確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序（7） 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈夠與肽鏈N-N-端的游離氨基作

24、用，生成二硝基苯端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（衍生物（DNP-DNP-肽）。肽）。l酸解，得黃色酸解，得黃色DNP-DNP-氨基酸，用乙醚抽提分離。氨基酸，用乙醚抽提分離。不同的不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。氨基酸可以用色譜法進行鑒定。（一）一）N N末端分析法末端分析法O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個反應是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個反應用途用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨

25、基酸末端氨基酸.DNSDNS + + AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白弱堿弱堿DNS-DNS-AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白酸酸DNS-AADNS-AA + +游離游離AAAA（乙醚抽提，有熒光）（乙醚抽提，有熒光）l在可用在可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍（使鹽酸胍（使蛋白變性，亞基分開）存在下，蛋白變性，亞基分開）存在下，使使用過用過量的量的 - -巰基乙醇巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，使二硫鍵還原為巰基，然后用然后用烷基化試劑烷基化試劑保護生成的巰基，以保護生成的巰基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化。(三三)氨基氨基酸組成的酸組成的分析：分析：酸，

26、堿解后酸，堿解后氨基酸分析氨基酸分析儀測定儀測定l1 1、 酶裂解法酶裂解法 胰胰蛋白酶蛋白酶蛋白水解酶（蛋白酶）：蛋白水解酶（蛋白酶）： 糜糜蛋白酶（肽鏈內切酶）蛋白酶（肽鏈內切酶）嗜嗜熱菌蛋白酶熱菌蛋白酶胃胃蛋白酶蛋白酶l胰蛋白酶胰蛋白酶Trypsin ：R R1 1= =賴氨酸賴氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg側鏈（專一性較強，水解速度快）側鏈（專一性較強，水解速度快）。l胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性胰蛋白酶胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性胰蛋白酶斷裂斷裂Phe,Trp,TyrPhe,Trp,Tyr等芳香族等芳香族AAAA的羧基形成的肽鍵。的羧基形成的肽鍵。NHCHCOR4NHCHC

27、OR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點水解位點2、化學試劑法：溴化氰。R1=R1=甲硫氨酸。l1 1、EdmanEdman化學降解法化學降解法lEdmanEdman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種析法實際上也是一種N-N-端分析法端分析法。此法。此法的特點是能夠不斷重復循環，將肽鏈的特點是能夠不斷重復循環，將肽鏈N-N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。 用途用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨末端氨基酸。基酸。亦稱亦稱EdmanEdman反應反應弱堿弱堿 AAAAPITC+ PITC+ 多肽多肽 蛋白蛋白 AAAAPTCPTC多肽多肽 蛋白蛋白無水甲酸無水甲酸或或HFHFPTH-AA + PTH-AA + 少一個少一個AAAA的多肽或蛋白的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）（乙酸乙酯抽提）此反應可循環進行此反應可循環進行 進行進行n n