1、萌發小麥種子中淀粉酶酶學性質研究（東北農業大學，生命科學學院，黑龍江省 哈爾濱市 150030）摘要： 酶是酶是一種生物催化劑，它具有催化劑屬性，同是也具有一些無機催化劑所不具有的特性。催化特定化學反應的蛋白質、RNA或其復合體。是生物催化劑，能通過降低反應的活化能加快反應速度，但不改變反應的平衡點。本實驗通過利用淀粉酶水解還原糖，還原糖能使3，5-二硝基水楊酸還原，生成棕色的3-氨基-5硝基水楊酸。淀粉酶活力與還原糖的量成正比，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位質量樣品在一定時間內生成還原糖的量表示酶活力。以淀粉在碘液中顯藍色性質，探究酶活性影響因素，常見的影響因素有：溫

2、度 pH 活性劑和抑制劑等。Abstract:Enzyme is a biological catalyst is an enzyme, the catalyst having the property, the same also has some inorganic catalysts do not have the characteristics. Proteins catalyze specific chemical reactions,RNA or a composite thereof. Are biological catalysts,by reducing the activa

3、tion energy of the reaction to accelerate the reaction rate, but does not change the equilibrium reaction. In this study, the use of enzymatic hydrolysis of starch sugar, sugar makes 3,5-dinitrosalicylic acid reduction ,a brown 3-amino-nitro-salicylic acid.Proportional to the amount of amylase activ

4、ity and reducing sugars,measuring the amount of amylase in starch sugar produced by colorimetry ,a unit mass of the sample at the certain time.關鍵詞： 淀粉酶 活性 溫度 PH 激活劑和抑制劑引言： 新陳代謝是生命活動的基礎，是生命活動最重要的特征。而構成新陳代謝的許多復雜而有規律的物質變化與能量變化，都是在酶催化下進行的。生物的生長發育、繁殖、遺傳、運動、神經傳導等生命活動都與酶的催化過程緊密相關，可以說，沒有酶的參與，生命活動一刻也不能進行。酶是細

5、胞產生的，受多種因素調節控制的具有催化能力的生物催化劑，與一般催化劑比較有以下不同點：酶易失活、酶具有很高的催化效率、酶具有高度專一性、酶活性受到調節和控制。而調節和控制又包括調節酶濃度、抑制劑和激活劑的調節等。1按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分為-淀粉酶、-淀粉酶、異淀粉酶和麥芽糖酶四種類型。實驗證明，當谷類種子萌發時，兩類淀粉酶（，型）都存在，淀粉酶總酶活性隨種子萌發將升高，有利于淀粉被降解為植物生長發育所需的葡萄糖。許多微生物包括細菌、真菌和酵母都能生產淀粉酶，這些廉價的淀粉酶來源，已廣泛應用于食品、醫藥、飼料和環保等生產實踐中。2酶活力是指酶催化某一化學反應的能力，酶活力的大小可以

6、在一定條件下所催化的某一化學反應的反應速率來表示。酶催化的反應速率越大，酶的活力越高；反應速率越小，酶的活力zx越低，所以測定酶的活力就是側訂酶促反應速率。3通過兩種方法可以進行酶活力的測定，其一測定完成一定量的反應時間，其二測定單位時間內的酶催化的反應量。而本實驗所采用的是方法二，測定5min內反應量。酶活力的測定方法有分光光度法、熒光法、同位素測定方法、電化學方法，還有一些適用于個別酶的方法，如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等。本實驗采用的是分光光度法。1 材料與方法 1.1材料實驗材料為小麥。 1.2主要實驗儀器及試劑離心機 分光光度計 容量瓶 研缽 電爐 恒溫水浴 離心管標準麥芽糖溶液

7、（1mg/ml） 3，5-二硝基水楊酸 0.1 mol/l的檸檬酸緩沖液 1% 淀粉溶液等 1.3實驗方法1.3.1麥芽糖標準曲線的制作取6支干凈的具塞刻度試管，編號，按表13-1加入試劑管號123456麥芽糖標準液/ml01.62.0蒸餾水/ml2.00.40麥芽糖含量/ml01.62.03,5-二硝基水楊酸/ml2.02.02.02.02.02.0光密度值00.0440.1010.1580.2150.273搖勻，置沸水浴煮沸5分鐘。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容只20ml. 以1號管作為空白調零點，在540nm波長下比色測定光密度。以麥芽

8、糖含量為橫坐標，光密度縱坐標，繪制標準曲線。實驗數據的記錄如表13-2麥芽糖含量01.62光密度值00.0440.1010.1580.2150.273標準曲線繪制如圖13-3 1.3.2淀粉酶粗酶液的提取稱取2g萌發3d的小麥種子，置于研缽中，加入少量石英砂和2mL蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿到入刻度試管中，定容至25mL。提取液在室溫下放置提取15-20min，每隔數分鐘攪動一次，使其充分提取。然后在4000r/min轉速下離心10min，將上清液倒入一個干凈的試管中，即為淀粉酶粗酶液。3 1.3.3酶活力的測定取3支干凈試管，編號，按表13-4加入試劑 表13-4 項目淀粉酶

9、活性的測定試管號II-1II-2II-3淀粉酶原液（ml）1.01.01.0鈍化-淀粉酶置于70水浴中15min,冷卻酶稀釋液 (ml)000預保溫將各試管和淀粉溶液置于40水浴中保溫10minPH5.6緩沖液（ml）1.01.01.00.4mol/LNaoH(ml)4.0001%淀粉（ml）2.02.02.0保溫在40恒溫水浴中5min0.4mol/L NaoH(ml)04.04.0取3支干凈試管，編號，按表13-5加入試劑 表13-5項目總淀粉酶活性的測定試管號II-1II-2II-3淀粉酶原液（ml）000鈍化-淀粉酶置于70水浴中15min,冷卻酶稀釋液 (ml)1.01.01.0預保

10、溫將各試管和淀粉溶液置于40水浴中保溫10minPH5.6緩沖液（ml）1.01.01.00.4mol/LNaoH(ml)4.0001%淀粉（ml）2.02.02.0保溫在40恒溫水浴中5min0.4mol/L NaoH(ml)04.04.0將各試管搖勻，分別取2ml放入25ml刻度管中，再加入2mlDNS試劑混勻沸水浴煮沸5min取出冷卻，再用蒸餾水稀釋至25ml混勻，在分光光度計上540nm處進行比色，測定光密度值，記錄測定結果。原始數據記錄：編號II-1II-2II-3 -淀粉酶0.1890.3120.314總 酶0.2450.4040.413 結果計算：-淀粉酶活性=(2.21-1.3

11、2）×25×8/1.1×2=80.9mg/g.min總酶活性 = (2.91-1.72）×25×8/1.1×2=216.3mg/g.min 1.3.4淀粉酶學性質的研究淀粉粉酶液的制備稱取2g萌發3d的小麥種子(芽長約1cm)，置于研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入刻度試管中，定容至25ml.提取液在室溫下放置提取15-20min, 每隔數分鐘攪動一次，使其充分提取。然后在4000r/min轉速下離心，將上清液倒入一個干凈的試管中，即為淀粉酶液。溫度對淀粉酶活性的影響取10支試管，編

12、號，按表13-6加入試劑，并記錄觀察到的結果表13-6溫度對淀粉酶活性的影響管號AaBbCcDd緩沖（PH=5.6）1-1-1-1-淀粉溶液/ml2.5-2.5-2.5-2.5-淀粉酶提取/ml-1-1-1-1預保溫10min4室溫40沸水浴混合A倒入aB倒入bC倒入cD倒入d酶促反（10min）4室溫40沸水浴碘液各3滴顯色藍色無色無色無色 PH對淀粉酶活性的影響取三支試管，編號，按表13-7記錄觀察到的顏色表13-7 PH對淀粉酶活性的影響IIIIII緩沖液/ml2（PH=3.0）2（PH=5.6）2（PH=8.0）淀粉溶液/ml各2.5淀粉提取液/ml各1酶促反應（10mi

13、n）搖勻，40水浴10min碘液各3滴顯色淺藍色無色淺藍色 激活劑和抑制劑對酶活性的影響取四支試管，編號，按表13-8操作，并記錄觀察到的顏色 表13-8活劑和抑制劑對淀粉酶活性的影響 IIIIII緩沖液/ml（ph=5.6）各2mlNaCL1-CuSO4-1-H2O-1淀粉溶液各2.5ml酶提取液各1ml酶促反應混勻，4010min碘液各1滴顯色無色淺藍色無色2 實驗現象 2.1溫度對淀粉酶活性的影響現象分析：淀粉酶的最適溫度是40，溫度偏高偏低都會影響酶的活性甚至導致酶的失活。致使在一定時間內淀粉的水解，如果淀粉失活這淀粉不水解（例如本實驗的100的試管）。在一定溫度范圍內，

14、淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強，當達到某一溫度（40左右）時，酶的活性達到最大，當超過這一溫度后，酶的活性隨溫度的升高而減弱。 2.1PH對淀粉酶活性的影響現象分析：pH=5.6是小麥淀粉酶的最適PH。 PH值是影響酶活的主要因素，通常各種酶只在一定的PH范圍內才表現出活性，同一種酶在不同的PH下所表現的活性不同，其活性最高時的PH稱為酶的最適PH值。PH影響酶分子構象的穩定性,影響酶分子極性基團的解離狀態,也影響底物的解離。PH值不是酶的特定常數,它可隨底物的濃度和種類、酶的純度、緩沖液的種類和濃度、溫度、反應時間長短以及抑制物的作用等而改變。 2.3激活劑和抑制劑對淀粉酶活性的影響現象分析

15、：NaCl中Cl離子為淀粉酶激活劑，Cl離子使淀粉酶活性增強；CuSO4中Cu離子為淀粉酶抑制劑，Cu離子使淀粉酶活性減弱,水對酶活性幾乎無影響。3 實驗結果分析 3.1溫度對淀粉酶活性的影響4：酶的活性幾乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍色；室溫：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈淺藍色；40：酶的活性達到相對最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近無色；沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍色；由此可以看出40是小麥淀粉酶的最適溫度。淀粉酶的最適溫度是40，溫度偏高偏低都會影響酶的活性甚至導致酶的失活。致使在一定時間內淀粉的水解，如果淀粉失活這淀粉不水解

16、（例如本實驗的100的試管）。在一定溫度范圍內，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強，當達到某一溫度（40左右）時，酶的活性達到最大，當超過這一溫度后，酶的活性隨溫度的升高而減弱。5 3.2PH對淀粉酶活性的影響PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深藍色較深PH=5.6：淀粉酶活性達到相對最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈無色PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈藍色由此可以看出pH=5.6是小麥淀粉酶的最適PHpH=5.6是小麥淀粉酶的最適PH。 PH值是影響酶活的主要因素，通常各種酶只在一定的PH范圍內才表現出活性，同一種酶在不同的PH下所表現的活性不同，其

17、活性最高時的PH稱為酶的最適PH值。PH影響酶分子構象的穩定性,影響酶分子極性基團的解離狀態,也影響底物的解離。PH值不是酶的特定常數,它可隨底物的濃度和種類、酶的純度、緩沖液的種類和濃度、溫度、反應時間長短以及抑制物的作用等而改變。 3.3激活劑與抑制劑對淀粉酶活性的影響空白對照組：加入碘液后幾乎呈無色加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈無色加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深藍色由此可以看出NaCl是小麥淀粉酶的激活劑；CuSO4小麥淀粉酶的抑制劑NaCl中Cl離子為淀粉酶激活劑，Cl離子使淀粉酶活性增強；CuSO4中Cu離子為淀粉酶

18、抑制劑，Cu離子使淀粉酶活性減弱，水對淀粉酶活性幾乎無影響，酶的抑制劑分類大致分為可逆抑制和不可逆抑制，酶的抑制劑的研究對生物化學相關實驗的開展有著重要意義。4 討論 4.1實驗討論1、 溫度、環境PH值、激活劑、抑制劑是影響酶活性的幾個重要因素，研究其中一個因素對酶活性的影響時，要控制其他因素不變（其他因素盡量控制在使酶活性最高的水平上），從而研究這一單一因素對酶活性的影響。通過對淀粉酶活性初步研究得出結論如下：溫度、PH、激活劑、抑制劑是影響淀粉酶活性的重要因素。在一定溫度范圍內，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強，當達到某一溫度（40左右）時，酶的活性達到最大，當超過這一溫度后，酶

19、的活性隨溫度的升高而減弱;在一定PH范圍內，酶的活性隨PH的升高而升高，當達到某一PH（5.6左右）時，酶的活性達到最大，當超過這一PH時，酶的活性隨PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增強Cu2+使酶活性減弱。通過與他人的實驗結果比較發現，該實驗容易出現個體偏差。實驗耗時長短結果會有偏差。 萌發天數不同的材料，糖化時間不同。春季與冬季測定的結果有較大差異。估計酶的性質可能受多種因素影響。2、通過對淀粉酶活性初步研究,說明溫度、PH、激活劑、抑制劑是影響淀粉酶活性的重要因素。在一定溫度范圍內，淀粉酶的活性隨溫度的升高而增強，當達到某一溫度（40左右）時，酶的活性達到最大，

20、當超過這一溫度后，酶的活性隨溫度的升高而減弱;在一定PH范圍內，酶的活性隨PH的升高而升高，當達到某一PH（5.6左右）時，酶的活性達到最大，當超過這一PH時，酶的活性隨PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增強Cu2+使酶活性減弱3。3、研究酶有重要的意義。生物體內的各種代謝變化都是由酶驅動的,酶有兩種功能:其一,催化各種生化反應,是生物催化劑;其二,調節和控制代謝的速度、方向和途徑,是新陳代謝的調節元件。酶對細胞代謝的調節主要有兩種方式:一是通過激活或抑制以改變細胞內已有酶分子的催化活性;另一種是通過影響酶分子的合成和降解,以改變酶分子的含量。這種酶水平的調節機制是代謝的最關鍵的

21、調節4。現代酶學正向著兩個方向發展：酶的分子生物學和酶工程學，它們是現代生物技術的重要組成部分，應用范圍包括醫藥，食品，化學工業，診斷分析和生物傳感器，涉及的品種不少，如淀粉酶，其市場需求生產規模和產值均很樂觀，并已產生巨大經濟效益5。 4、對于酶活力測定的方法有很多,比如測定酶活性的凝膠擴散法和組織印漬法3,該法建立了改良凝膠擴散法和組織印漬法檢測-淀粉酶活性的方法,此法的實驗條件容易控制,重復性好。組織印漬法在玉米種子吸水約5h后即可檢測到-淀粉酶活性; 再如2-氯-4-硝基苯-半乳糖-麥芽糖苷作底物直接測定-淀粉酶法,該法用新底物2氯4硝基苯半乳糖麥芽糖苷（GalG2CNP）直接測定淀粉酶，不需