1、第31卷 第6期2010年6月儀器儀表學報Ch i nese Journa l o f Sc ientific Instru m entV ol 31N o 6Jun . 2010收稿日期:2008 12 R ece i ved D ate :2008 12*:( 葉綠素熒光檢測技術及儀器的研究*趙友全1, 魏紅艷1, 李 丹1, 劉憲華2, 張 鑫2, 劉子毓1(1 天津大學精密儀器與光電子工程學院 天津 300072; 2 天津大學環境學院 天津 300072摘 要:湖泊水華的爆發給人們日常生活和生產帶來很大的危害, 水體富營養化、水中浮游植物和藻類的大量繁殖是產生水華的主要原因。水中葉綠

2、素可作為水體營養的跟蹤指示器, 快速檢測水中的葉綠素含量可以預警水體營養程度和水質污染。基于葉綠素熒光的光譜特征, 提出了一種可快速現場用的水體營養檢測技術、研制了葉綠素熒光檢測儀器, 通過現場實驗跟蹤監測了天津大學敬業湖水體在春夏之交的浮游植物含量的分布、生長和氣候變化的影響。關鍵詞:水華; 富營養化; 葉綠素; 熒光光譜中圖分類號:X 85 文獻標識碼:A 國家標準學科分類代碼:610. 3040Research on the techni que and i nstru m ent of chl orophyll fl uorescence m easure m entZhao Y ou

3、quan 1, W eiH ongyan 1, LiD an 1, L i u X ianhua 2, Zhang X in 2, L i u Ziyu1(1C ollege of P recision Instru m ent and Op t o E lectronics Engineer i ng, T ianjin Un i ver sit y, T ianjin 300072, China;2School of Environ m ental Science and Eng i neering , T ianjin Universit y, T ianjin 300072, Ch i

4、 naAbst ract :W ater bloo m in lakes brings a great danger to da ily life and producti o n , wh ich is pri m aril y due to w ater eutroph ication and rap i d i n crease o f the a m ount of algae and phytop lankton . A s an i n dicator ofw ater eutroph ication, rapid detection o f chlorophy ll conten

5、t i n w ater can pred i c t the ex tent ofw ater eutroph icati o n and po llution . Based on t h e spectra l characteristics o f ch l o r ophy ll fl u orescence , t h is paper reports a ne w techn i q ue for the m easure m en t of eutroph icati o n and a chlorophyll fluorescence detecting instrum en

6、. t The sensitiv ity o f the i n str um ent is up to 3 10-6. A lot o f experi m ents of track i n g the d istri b uti o n and gro w th of phytoplankton , and the i m pact o f c li m ate change w ere carried out i n the Jingye lake i n T ian jin Un iversity . K ey w ords :w ater b l o o m; eutroph ic

7、ation; ch l o rophy l; l fluorescence spectrum1 引 言近年來, 我國連年出現太湖、蕪湖、松花江等水危機, 由于藍綠藻類在水體中持續爆發, 使得水中浮游植物劇增、水中氧分耗盡、水體呈現大面積缺氧狀態, 水中生物因此大量死亡。由于水中藻類的快速生長, 水面上綠藻堆積, 造成水流困難, 水體無法與外界進行空氣交流, 逐日變得惡臭, 給人們的生產、生活和生命健康都帶來了極大的危害。目前國內各湖區水庫的相關監測站和環境研究所大都對水體的富營養化程度進行了監測, 包括化學需氧量、總氮、總磷、葉綠素a 含量等單項指標和按一定模型計算的綜合指數的富營養化評價1

8、2。綜合指數評價大都在實驗室或者特定條件下進行細胞培養來進行, 由于取水樣和運輸等問題, 存在較大的測量誤差, 而且不是現場測定, 其結果有著很大的時間滯后性, 再現性難以保證。水體富營養化可以通過跟蹤監測水中葉綠素的含量來實現, 其中葉綠素a 是所有葉綠素中含量最高的, 因此葉綠素a 的測定能示蹤湖泊的富營養化程度。已有的水體葉綠素a 的測量方法有很多種, 包括高性能液相色譜法(HPLC 、分光光度法、實驗室熒光法和遙感法3。前3種方法都屬于實驗室方法, 需要將葉綠素從浮游植物體內提取出來, 不僅工作量大, 而且整個過程中干擾因素很多, 最后很可能得到錯誤的數據。遙感法不必萃取, 是一種在線

9、測量的方法, 但是僅適用于大面積的水域, 而且航拍工作要求很高, 檢測結果處理復雜。本文提出一種新的現場可用的熒光法測定水中的葉綠素, 具有靈敏度高、無需試劑、速度快、實時性好的優點, 可用于湖泊、河流、海洋等水體富營養化現場檢測4 7; 大量實驗測定證明了這種新技術和新儀器可用于現場檢測湖泊中浮游植物的生長和分布, 以及在不同氣候條件下的變化情況。2 葉綠素熒光光譜特性及測量原理當用一定波長的光照射浮游植物時, 其葉綠素分子受到激發后會以輻射躍遷形式將其吸收的能量釋放返回基態時, 便會發射出波長大于激發光的熒光8。在熒光光譜工作中, 涉及2種光譜:激發光譜反映了在不同激發波長下所測得的熒光強

10、度對激發波長的依賴關系, 由此可找到對該種試樣的最佳激發波長; 熒光發射光譜反映在固定激發波長下所測量得的熒光強度與波長的對應關系, 由此可找到最佳檢測波長。如圖1所示為葉綠素a 的激發光譜和發射光譜。圖1 葉綠素a 的激發光譜和發射光譜F i g . 1 Ex cita tion and em iss i on spectru m o f ch l o rophy ll a浮游植物的葉綠素分子受到激發后發射出的熒光強度I f 與其吸收光強度I a 、被激發物質的熒光量子產率Y f 有關9 10, 即:I f =Y f I a (1而吸收的光強度I a 等于入射光強度I 0減去透射光強度I t

11、 , 于是:I f =Y f (I 0-I t =Y f I 0(1-I t /I0(2由朗伯 比爾定律可知, 吸光度A =kbc , 透光度T =I t /I0, 所以:I t /I0=e-kbc(3 (2 :I f =Y f I 0(1-e-kbc(4根據級數展開公式:e -kbc =1-kbc +(kbc 2/2! -(kbc 3/3! +(kbc4/4! +(5當kbc 非常小(<<0. 05 時, e -kbc! 1-kbc 代入式(4, 得:I f =Y f I 0kbc(6當用摩爾吸光系數 代替k 時, 即得:I f =2. 303Y f I 0 bc (7 式中:c

12、 為葉綠素a 的濃度, 單位為L ; b 為樣品光程差(葉層的厚度, 單位為c m 。也就是說, 如果已知葉綠素a 的熒光量子產量Y f , 然后通過測量它的熒光強度I f 就可以計算出它的濃度c 。3 測量儀器裝置該葉綠素熒光檢測儀器硬件電路以CYP RESS 公司的27643單片機作為核心, 主要由光學模塊、信號處理模塊和數據通信模塊組成11, 設計框圖如圖2所示。圖2 硬件電路設計框圖F i g . 2 Block d i agra m o f the hard w are c ircu it在光學模塊中, 激發光源采用峰值波長為460n m 的藍色LED , 由單片機P WM 輸出10

13、24H z 方波作為載波信號, 通過模擬開關將恒流源變為高頻的電流脈沖, 用該電流脈沖給LED 供電, 實現激發光源調制12。針對LED 的光強比激光器、汞燈、氙燈等高功率光源光強弱很多、激發的熒光信號也很微弱, 熒光檢測模塊選用了專門針對光電二極管設置的互阻放大器, 將微弱信號放大的同時實現電流/電壓轉換。信號處理模塊主要是信號增益調整電路。從光電二極管輸出的電壓信號首先進行前置放大; 前級弱輸出的信號進入單片機集成PGA 進行程控放大; 為消除背景光產生的噪聲, 采用AD620差動放大去除背景噪聲影響,數據通信模塊采用系統嵌入式集成A /D實現信號采集, 在PSo C D es i gne

14、r 中編寫程序并通過RS232與上位機或數據采集系統通信13 14。4 儀器的校正與實驗4. 1 儀器性能的考核及標準曲線的繪制該葉綠素熒光測量儀器測量范圍:0500 g /L, 測量最小限:0. 03 g /L。按照分光光度法測量水體葉綠素的標準過程提取葉綠素, 并將其溶解在丙酮中, 每隔5m i n , 對該溶液進行6次重復測量, 測量結果如表1所示。表1 重復性實驗數據T ab le 1 Th e data of rep eatab ility experi m en t測量次數 測量值/mV1271. 72271. 83271. 84271. 85272. 16271. 8根據重復性的

15、定義, 按貝塞爾公式計算得到的標準方差為0. 1225, 證明儀器具有較好的重復性。依據國家標準方法, 對采集到得實際水樣用分光光度多波長法測定其中含有葉綠素濃度, 同時對該水樣稀釋成不同倍數, 使用葉綠素熒光儀器分別測量稀釋后的水樣得到電壓值如圖3所示。 圖3 水樣實驗測定結果f e線性回歸分析得相關系數為0. 9973, 說明葉綠素熒光檢測儀器測得的電壓值與溶液的葉綠素濃度成較好的線性關系。4. 2 湖泊浮游植物的動態跟蹤用校正后的熒光儀對天津大學敬業湖葉綠素a 的含量進行監測, 從而實現對一定時期內浮游植物數量動態變化的跟蹤, 并從多個角度對現場監測所得的數據進行分析, 就可以尋找出浮游

16、植物在天然水體中的生長特點和規律。圖4是根據熒光儀測得四月份的葉綠素a 濃度繪制而成的分布圖, 其中:橫坐標代表湖長, 縱坐標代表湖寬m, 灰度由深到淺代表葉綠素a 的濃度由高到低變化。 (d 4月30日圖4 四月湖中葉綠素a 濃度分布變化情況F i g. 4 M on it o ring data of ch l orophyll a concentra tion in A pril從圖4可以看出:四月份開始監測時, 浮游植物已有大量生長, 到中旬生長加速。但是到了四月下旬, 浮游植物濃度有明顯的下降。根據現場的觀察, 湖內大型藻類生長較為旺盛。所以可以推測, 可能是由于溫度升高和強烈光照為

17、其提供了適宜的生長環境, 使其迅速生長, 從而將水中的營養物質消耗, 使浮游植物的生長受到限制。這種假設也在天津大學校園內的其他湖泊得到了印證:在某些有常年大量挺水植物(主要是蘆葦和荷花 生長的水面, 水體十分清澈, 濁度較低, 即浮游植物的量較少15。另外, 四月下旬, 正是魚類繁殖的季節, 大量以浮游植物為食的魚類的出現, 對水華的產生起到了一定的抑制作用。4. 3 湖泊浮游植物的空間分布湖中心區和岸邊空間位置的不同, 會對浮游植物的生長有明顯的影響。實驗選取同一監測日湖內9個監測點和與之對應的岸邊位置的葉綠素濃度數據, 其中9個點排列為3行3列, 5點位于湖心, 其他8點沿湖岸均勻分布。

18、從表2所示數據明顯可以看出, 湖邊葉綠素濃度總體上是高于對應的湖內濃度的。這點在圖4也有體現, 與多數天然湖體的藍藻水華爆發于岸邊相吻合。出現這種分布不同主要有兩個方面的原因:一方面, 岸邊多有排污源頭, 水質的富營養化程度嚴重; 另一方面, 岸邊水深較淺, 水動力條件穩定, 適宜浮游植物生長。表2 湖內和岸邊監測數據對比T ab l e 2 Th e m on itoring data of th e lake監測點湖內濃度/(mg L-1岸邊濃度/(mg L-111472202232190318631542502075162625921372091908212217 5 結 論本文基于葉綠

19、素熒光的光譜特征, 研制開發了可用于湖泊、河流、海洋等水體富營養化現場檢測監測的新技術和新儀器, 與其他測量方法相比具有靈敏度高、無需試劑(不會產生二次污染 、速度快、實時性好的優點, 文中也給出了葉綠素熒光法的測量原理、光源驅動電路、信號自動增益調整電路和信號傳輸電路等有關內容。用國家標準方法對本文研發的葉綠素熒光測量技術和儀器進行了標定、驗證了可靠性; 用標定后的儀器跟蹤監測了天津大學敬業湖在春夏之交的浮游植物含量, 并從時間和空間2個方面進行了分析, 從而驗證了此種檢測技術和研發儀器的可用性。參考文獻1 夏達英, 王振先, 夏靜芳. 海水葉綠素a 現場測量儀研究J.海洋與湖沼, 1997

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