1、    RHBV疫苗接種引起的特異性細胞免疫反應(1)    】 目的 研究小鼠免疫接種基因重組乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)產生的特異性細胞免疫反應。方法 40只BALB/c小鼠隨機分為0.65、1.25、2.5、5g 4組，腹腔分別接種0.65、1.25、2.5、5g的rHBs 1次或2次。初次免疫后4周或加強免疫后2周分離小鼠脾T淋巴細胞，分別進行脾T淋巴細胞釋放IFNr、IL-2及細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte

2、，CTL)實驗；脾T淋巴細胞釋放實驗：用10g/ml rHBs刺激脾T淋巴細胞，3天后用ELISA方法檢測培養液中IL-2及IFNr的濃度。CTL實驗，脾T淋巴細胞用特異性多肽刺激，用51Cr釋放實驗檢測CTL。結果 只接受單次免疫的0.65、1.25、2.5、5g組小鼠脾T淋巴細胞釋放的IL-2分別為5.48±8.88、9.28±6.98、28.53±14.32、64.69±20.88pg/ml，釋放的IFNr分別為8.22±8.61、9.89±9.34、20.27±15.50、30.77±22.12pg/ml。

3、接受加強免疫的0.65、1.25、2.5、5g組小鼠脾T淋巴細胞釋放的IL-2分別為5.75±5.04、102.53±67.52、177.13±91.12、332.10±124.31pg/ml，釋放的IFNr分別為3.63±4.42、28.33±13.04、59.66±25.75、80.73±19.30pg/ml。CTL反應的靶細胞自然釋放率為28.76%±13.45%；加強免疫組小鼠0.65、1.25、2.5、5組小鼠，CTL特異性釋放率分別為(42.36±19.32)%、(91.21

4、7;22.97)%、(69.25±24.13)%、(51.49±21.661)%；只接受1次免疫接種的小鼠，其脾淋巴細胞特異性CTL特異性釋放率分別為(32.27±15.35)%、(56.28±24.35)%、(44.34±18.65)%、(40.76±56)%。結論 小鼠接種rHBs后，脾T淋巴細胞產生特異性CTL反應，并特異性分泌IL-2、IFNr，反應強度與是否加強免疫及接種的劑量密切相關。    【關鍵詞】 HBV疫苗；免疫接種；小鼠；脾T淋巴細胞；IL-2；IFNr；CTL反應

5、0;   The cellular immune response to recombinant HBV vaccine        【Abstract】 Objective Hepatitis B virus(HBV) surface vaccine(rHBs) specific MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses induced by immunization with rHBs in mu

6、rine were assayed.Methods BALB/c(H-2d) murine were injected intraperitoneal(i.p.)with rHBs at doses ranging from 0-6 g and boosted after 2 weeks. 4 weeks after the last immunization，to measure the IL-2 and IFNr，spleen lymphocytes were harvested and restimulated with rHBs in experimental group o

7、r with PBS as control，4 weeks later after the last vaccination. For CTL assay，spleen cells were restimulated in vitro with specific peptides，which represents a Ld-restricted CTL epitope of the S-protein in H-2d BALB/c murine. The specific cytotoxic reactivity of in vivo primed and in vitro rest

8、imulated cells was tested against P815 cells impulsed with specific peptides and labeled with 51Cr. 4 hours release assay of 51Cr was performed. Results 2 weeks after primary vaccination，the IL-2 were 5.48±8.88，9.28±6.98，28.53±14.32，64.69±20.88 respectively；IFNr were 8.22±8.

9、61，9.89±9.34，20.27±15.50，30.77±22.12 separately. 2 weeks after boost vaccination，the IL-2 were 5.75±5.04，102.53±67.52，177.13±91.12，332.10±124.31 separately；IFNr were 3.63±4.42，28.33±13.04，59.66±25.75，80.73±19.30 separately. For CTL assay，the per

10、centages of specific release of the mouse spleen lymphocyte in group 0.65 g、1.25 g、2.5 g、5 g were 42.36%±19.32%、91.21%±22.97%、69.25%±24.13%、51.49%±21.661%，respectively. For the mouse receive only priming vaccination，the percentages of specific release of the mouse spleen lymphocy

11、te in group 0.65、1.25、2.5、5 were 32.27%±15.35%、56.28%±24.35%、44.34%±18.65%、40.76±56% respectively. Conclusion Injection with rHBs efficiently prime MHC-I restricted CTL response to the S-HBsAg in BALB/c(H-2d) murine，which was enhanced by boosting injection.    

12、;    【Key words】 rHBs；murine；immunization；spleen T lymphocytes；IL-2；IFNr；CTL reaction         乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一種嚴重危害人體健康的常見疾病，全世界有3.5億HBV感染者。接種基因重組HBV表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)能產生保護性抗體，已廣泛用于預防HBV感染。然而抗HBV特異

13、性細胞免疫反應決定HBV感染的預后，細胞免疫反應不足，即使抗HBV特異性體液免疫反應較強，也常導致HBV持續感染，清除體內已有的HBV、治療HBV感染需較強的抗HBV特異性細胞免疫反應。        接種rHBs能否產生HBV特異性細胞免疫反應，能否用于治療HBV感染還不十分清楚。筆者給小鼠接種rHBs，研究其脾T淋巴細胞能否產生特異性CTL反應，能否釋放特異性細胞因子，對接種rHBs產生的特異性細胞免疫反應進行定量及功能分析。       &

14、#160;1 資料與方法        1.1 試劑 rHBs含HBV表面抗原preS2/S，酵母基因重組產品，Merck公司生產。合成的特異性多肽IPQSLDSWWTSL(S28-39)，為H-2d BALB/c小鼠Ld限制rHBs-CTL表位(Saibaisheng公司生產)，以50 mg/ml濃度溶解在70%乙腈或0.1% DMSO儲存液中，臨用前以培養液稀釋。Na251CrO4購自中國同位素公司。IL-2及r-IFN檢測試劑盒：U-CyTech公司。     

15、;   1.2 實驗動物 BALB/c小鼠。610周齡，SPF級。        1.3 方法        1.3.1 BALB/c小鼠免疫接種 小鼠按以下分組，腹腔內分別接種不同劑量的rHBs，一半小鼠2周后加強免疫接種1次，另一半只接種1次：0.65組(10只)，接種0.65g的rHBs；1.25組(10只)，接種1.25g的rHBs；2.5組(10只)，接種2.5g的rHBs；5組(10只)，接種5

16、g的rHBs。        1.3.2 小鼠脾T淋巴細胞分離培養 接種后2周，氯仿麻醉小鼠，脫頸處死小鼠，分離脾細胞，8.3% NH4Cl/0.17mol/LTris (pH 7.4)37作用10min去除紅細胞，過玻璃毛柱，收集T淋巴細胞；用100：1含10% 胎牛血清、5×10-5mol/L二硫蘇糖醇的DMEM完全培養液，以5×105/well濃度接種在96孔細胞培養板上，每例作3個重復孔。        &#

17、160;   【摘】目的研究小鼠免疫接種基因重組乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)產生的特         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。        1.3.3 IL-2、IFNr釋放實驗

18、 小鼠脾T淋巴細胞，用10g/ml rHBs體外刺激3天后，用U-CyTech公司的ELISA檢測試劑盒測定培養上清的IL-2及FNr濃度。    1.3.4 51Cr釋放CTL反應 靶細胞，P815細胞用特異性多肽處理，用100ul Na251CrO4在二氧化碳培養箱37標記h。效應細胞，用含10% FCS的DMEM培養液懸浮小鼠脾細胞，加巰基乙醇至5×10-5M、小鼠IL-2至5u/ml，二氧化碳培養箱內培養5天后，培養液沖洗次，按100:1、50:1與104標記的靶細胞在96孔細胞培養板上反應h，每個實驗對象檢測3次；離心后，取100ul

19、上清用r-記數計檢測放射性，用以下公式計算特異性釋放率，CTL特異性釋放率=(實驗組釋放的量-自然釋放的量)/(最大釋放的量-自然釋放的量)。    1.4 統計學處理 CTL特異性釋放率、培養上清的IL-2及r-IFN濃度以平均數±標準差來表示(x±s)，不同組小鼠脾T淋巴細胞釋放的IL-2及IFNr比較、CTL特異性釋放率比較均用t檢驗。        2 結果       

20、0;2.1 小鼠脾T淋巴細胞特異性CTL反應 只接受1次免疫接種的小鼠脾淋巴細胞特異性CTL反應，0.65、1.25、2.5、5組小鼠CTL特異性釋放率分別為(32.27±15.35)%、(56.28±24.35)%、(44.34±18.65)%、(40.76±56)%。        接受2次免疫接種的小鼠脾淋巴細胞與未經特異性多肽作用的靶細胞反應，CTL特異性釋放率分別為：(42.36±19.32)%、(91.21±22.97)%、(69.25

21、7;24.13)%、(51.49±21.661)%。            2.2 小鼠脾T淋巴細胞釋放的IL-2和IFN-r 結果見表1。表1 各組小鼠初次免疫及加強免疫脾T淋巴細胞釋放的IL-2和FN-r    Tab 1 The production of IL-2 and IFN-r from the spleen T lymphocyte from the mouse boost vaccinated with rH

22、Bs （ng/L，x±s，n=40）Notes: vs control 0.05；*group*P<<0.01    3 討論        HBV感染是一種嚴重危害人體健康的常見疾病，全世界有3.5億HBV感染者。多數成年人感染HBV后，機體能夠自動清除HBV，表現出一種急性、自限性病程，而只有5%的成年人感染HBV后，雖然有強烈的抗HBV特異性體液免疫反應，但由于抗HBV特異性細胞免疫反應較差、機體免疫反應不能清除HBV而成為慢性HBV感染，其中部分

23、患者最終發展成為肝硬化、肝癌。目前治療HBV感染主是干擾素(interfern，IFN)及拉米夫定(lamivudine)，但只對轉氨酶增高的部分患者有效，而且存在副作用較多、停藥后易復發等缺陷。疫苗接種能激發機體產生特異性免疫反應，是預防及治療病原微生物感染簡單有效的方法；rHBs接種能產生強烈的抗HBV特異性體液免疫反應，很早就用于預防HBV感染，但是接種rHBs能否產生較強的抗HBV特異性細胞免疫反應，能否治療HBV感染還不十分清楚。筆者給小鼠接種rHBs，研究其脾T淋巴細胞能否產生特異性淋巴細胞CTL反應，能否釋放特異性細胞因子，對接種rHBs產生的特異性細胞免疫反應進行定量及功能分析

24、16。        研究發現，接種rHBs的小鼠脾T淋巴細胞在體外再受rHBs或HBV特異性多肽刺激后：(1) 特異性CTL反應 各實驗組特異性CTL釋放率以1.25組的最大，0.65組的最小。提示隨著rHBs接種劑量增加，開始時特異性CTL反應逐步增強，1.25g rHBs接種劑量的CTL特異性釋放率達到最高值，進一步增加接種劑量并不能增強特異性CTL反應，CTL特異性釋放率反而降低。同一劑量組的小鼠，加強免疫組的CTL特異性釋放率普遍比單次免疫組的高，二者差異有顯著性，表明加強免疫也能增強特異性CTL反應。(

25、2) IL-2、IFN-r的分泌是劑量依賴性的，加強免疫或增加接種劑量使脾T淋巴細胞特異性CTL反應、IL-2，IFN-r的分泌顯著增加；(3) CTL反應、IL-2、IFN-r的分泌是HBV特異性的：不論是哪一個劑量組，不論是加強免疫還是單次免疫，淋巴細胞CTL反應中，小鼠脾T淋巴細胞均在體外用HBV特異性多肽刺激，檢測的是HBV特異性CTL釋放率；而小鼠脾T淋巴細胞分泌IL-2、IFNr的實驗，小鼠脾T淋巴細胞均在體外用rHBs刺激，檢測的是HBV特異性IL-2、IFNr釋放。(4)小鼠脾T淋巴細胞特異性CTL反應強度與其分泌的IL-2、IFNr有密切的相關性，CTL反應較強的組的IL-2

26、、IFNr分泌也較高，反之亦然。IL-2、IFN-r主由CD4( )的I型輔助T淋巴細胞(helper spleen lymphocyte type I subtype)分泌；CTL實驗反映的是CD8( )T淋巴細胞的功能，CD4( )與CD8( )T淋巴細胞在抗原呈遞、免疫信號傳遞等免疫反應環節中，相互依賴、相互作用，CD4( )T淋巴細胞通過分泌的淋巴細胞因子調節CTL功能，而CTL也分泌淋巴細胞因子；這可以解釋小鼠脾T淋巴細胞特異性CTL反應與IL-2、IFN-r分泌二者之間密切關系。        機體免疫

27、反應能夠清除HBV的急性、自限性HBV感染者，其體內存在抗HBV的多克隆、多特異性細胞免疫反應，包括CD4( )的I型輔助T淋巴細胞(T helper lymphocyte，Th1)分泌的細胞因子(IFNr，TNFa，IL-2)產生的非細胞溶解性抗HBV作用及CD8( )的細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)對HBV感染肝細胞的細胞溶解性抗HBV作用。研究發現，在淋巴細胞浸潤肝臟組織達高峰之前，機體已開始清除體內的HBV，而且與IFNr分泌高峰的時相一致，提示I型淋巴細胞分泌的細胞因子產生的非細胞溶解性抗HBV作用在CTL對HBV感染肝細胞的細胞溶解性抗HB

28、V作用之前即發揮作用，在機體清除HBV過程中起著重作用。但在抑制、清除肝細胞胞漿及肝細胞胞核的HBV共價、閉合、環狀DNA(covalently colsed circular DNA，cccDNA)的復制、清除體內HBV、治療HBV感染的過程中，CTL的細胞溶解性抗HBV作用則起著不可替代的作用。        對于機體免疫反應不能清除體內HBV的HBV慢性感染者，抗HBV特異性細胞免疫反應較弱，提示增強抗HBV特異性細胞免疫反應有助于清除體內的HBV，接種rHBs可以用于治療HBV感染。現在臨床上使用的抗HBV

29、特異性免疫球蛋白對預防HBV感染有效，但對治療體內已感染的HBV無效79。        由于HBV感染引起的免疫反應不能清除HBV，所以開始人們對于接種rHBs治療HBV感染抱懷疑態度。然而國外臨床實驗證實，給HBV感染者接種rHBs，通過提高抗HBV特異性細胞免疫反應，清除其體內的HBV，達到治療HBV慢性肝炎的目的。法國Stanislas等教授對接種rHBs治療HBV慢性肝炎進行了大范圍、多中心、隨機、對照研究：實驗組HBV慢性肝炎患者接受5次20g的rHBs皮下接種，發現與未接受治療的對照組相比，實驗組患者

30、血清HBV DNA轉陰率明顯較高，特別是接種前血清HBV DNA含量高于200pg/ml的患者，其血清HBV DNA轉陰率更高；實驗組患者HBe/anti-HBe血清轉換率為13.3%，而對照組只有3.6%。表明接種rHBs能夠抑制HBV慢性肝炎患者體內HBV復制，降低體內HBV含量，證實接種rHBs能提高抗HBV特異性細胞免疫反應，確實能夠治療HBV感染。            【摘】目的研究小鼠免疫接種基因重組乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant HBV surf

31、ace vaccine，rHBs)產生的特         本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。        HBV感染引起的免疫反應不能清除HBV，皮下接種較預防劑量高的rHBs能引起特異性細胞免疫反應，能用于治療HBV感染，究其原因可能與以下原因有關：(1) 接種途徑不同，研究證實，

32、腹腔或皮下含有較多的抗原提呈細胞樹突狀細胞(dentritic cell，DC)，而DC是目前已知的抗原提呈功能最強的抗原提呈細胞，腹腔或皮下接種能引起較強的特異性細胞免疫反應。(2) 接種劑量不同，細胞免疫反應強度與接種劑量有關，腹腔或皮下接種較預防劑量高的rHBs能引起明顯的特異性細胞免疫反應，小鼠0.125g的接種劑量相當于人10g的免疫預防接種劑量；Stanislas等教授采用的是給HBV患者5次20g的rHBs皮下接種，而一般預防HBV感染，3次510g的rHBs皮下接種就能得到滿意的預防效果；筆者的研究也證實，接種rHBs的小鼠脾T淋巴細胞在體外再受rHBs刺激后，脾T淋巴細胞特異

33、性CTL反應、IL-2、IFN-r的分泌是劑量依賴性的，加強免疫或增加接種劑量使脾T淋巴細胞特異性CTL反應、IL-2，IFN-r的分泌顯著增加10，11。        筆者的研究發現，BALB/c小鼠腹腔接種rHBs后2周，其脾淋巴細胞即產生抗HBV特異性CTL反應并分泌Th1淋巴細胞因子，提示接種rHBs有助于提高HBV慢性感染者抗HBV特異性細胞免疫反應，有可能用于治療已有的HBV感染，為治療HBV感染提供了一種新的免疫治療方法。【參考文獻】    1 Bhatnag

34、er PK，Papas E，Blum HE，et al. Immune response to synthetic peptic analogues of hepatitis B surface antigen specific for the “a” determinant. Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(6): 4400-4404.    2 Waters JA，ORourker SM，Richardson SC，et al. Qualitative analysis of the humoral immune res

35、ponse to the “a” determinant of HBs antigen after inoculation with plasma-derived or recombinant vaccine. J Med Virol，1987，21(1): 155-160.    3 Neurath AR，Kent SBH，Parker K，et al. Antibodies to a synthetic peptide from the preS 120-145 region of the hepatitis B virus en

36、velope are virus-neutralizing. Vaccine，1986，4(1): 35-37.    4 Neurath AR，Kent SBH，Strick N，et al. Identification and chemical synthesis of a host cell binding site on hepatitis B virus. Cell，1986，46(2): 429-436.    5 Guidotti LG，Ando MV，Hobbs T，et al. Cytotoxic T lymphocytes inhibit hepatits B virus gene expression by a noncytolytic mechanism in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(