1、熒光定量PCR檢測人PDGFB mRNA方法的建立與運用    【摘要】nbsp;nbsp;目的:克隆人PDGFBnbsp;mRNA的cDNA，并以此作標準品，建立TaqMan技術實時定量檢測人PDGFBnbsp;mRNA的方法并加以應用。方法:RT-PCR擴增人PDGFBnbsp;mRNA，將純化產物與pMD18-T載體連接，轉化DH-5感受態細胞。提取重組質粒，以PCR擴增、限制     作者單位：溫州醫學院 浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035    【

2、摘要】  目的:克隆人PDGFB mRNA的cDNA，并以此作標準品，建立TaqMan技術實時定量檢測人PDGFB mRNA的方法并加以應用。方法:RT-PCR擴增人PDGFB mRNA，將純化產物與pMD18-T載體連接，轉化DH-5感受態細胞。提取重組質粒，以PCR擴增、限制性內切酶雙酶切、測序進行鑒定，作為標準品，建立實時定量檢測人PDGFB mRNA的方法，用以檢測HBSAg陰性組和HBSAg陽性組PDGFB mRNA含量。結果:PCR擴增、雙酶切鑒定及測序分析均證實PDGFB cDNA重組成功。實時定量檢測PDGFB mRNA后發現，HBSAg陰性組和HBSAg陽性組的Ct

3、值分別為(32.185±2.006)和(21.769±5.256)，濃度分別為(1.27±0.87)×107拷貝/106PBMC和(1.24±0.58)×109拷貝/106PBMC(P<0.05)，后者PDGFB mRNA含量明顯高于前者。結論:本研究成功克隆了PDGFB熒光定量PCR標準；熒光定量PCR檢測人PDGFB mRNA含量具有快速、準確、簡便，特異性強等優點，適用于臨床檢測。 【關鍵詞】  血小板衍生因子-B 逆轉錄-聚合酶鏈反應 T-A克隆 實時定量 乙肝病毒表面抗原    

4、 Establishment and application of the method for determining human PDGFB mRNA with real-time quantitative polymerase chain reaction  ZOU Li-lin, DING Zhi-nan, WANG Zhen, et al. Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035     Abstract:&

5、#160; Objective:To clone cDNA of human PDGFB and to use it as the standards for real-time quantifying PDGFB mRNA. Methods: Human PDGFB cDNA was amplified with RT-PCR, then ligated with pMD18-T vector and transformed into bacterium DH-5. Plasmid DNA extracted from positive clones was amplified by PCR

6、 and digested with restriction endonucleases and sequenced. The recombinant plasmid DNA was used as the standards for the establishment of the method of real-time quantifying PDGFB mRNA. PDGFB mRNA from person with HBsAg negative and HBsAg positive was detected. Results: PDGFB cDNA cloning was prove

7、d by PCR amplification, digestion and sequence analysis. Determining PDGFB mRNA of person with HBsAg negative and HBsAg positive, Ct value was 32.185±2.006 and 21.769±5.256 respectively, and concentration was (1.27±0.87)×107copies/106PMBC and (1.24±0.58)×109 copies/106P

8、MBC respectively. Conclusion: The method based on TaqMan technology can accurately quantify PDGFB mRNA, and it is suitable for clinical laboratory use.     Key words:  platelet-derived growth factor beta; reverse transcription-polymerase chain reaction; T-A Cloning; real-time qua

9、ntification; hepatitis B surface antigen     血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)可以分為血小板衍生生長因子A（PDGFA）和血小板衍生生長因子B(PDGFB)，它是由多種細胞產生的內源性多肽類生長因子，參與機體的多種病理、生理的調節過程1，如組織修復、胚胎發育及免疫調節等。隨著對其研究的深入，PDGF與疾病的關系逐步為人們所重視，PDGF與肝纖維化的發生和發展密切相關，在肝纖維化的病理生理過程中起重要作用2。目前，定量檢測PDGFB mRNA的方法，主要是采用逆轉

10、錄-聚合酶鏈反應的方法。本研究通過T-A克隆法重組人PDGFB cDNA，以此重組質粒作為標準品，建立實時定量PCR檢測PDGFB mRNA的方法，并用來檢測HBSAg陰性組和HBsAg陽性組的PDGFB mRNA含量。     1  材料和方法     1.1  標本來源  收集溫州醫學院第一附屬醫院HBsAg陰性體檢者和HBsAg陽性患者各20例，分別取EDTA抗凝靜脈血2 ml。     12  試劑及儀器  RT-PCR體系、pMD18-T載體、D

11、H-5菌種、限制性內切酶EcoRI/HindIII、DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA小量純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司生產）、PCR儀（BIO-RAD/Mycycler）、熒光定量PCR儀（MJ Opticon 2）、紫外凝膠分析系統（GENE GENIUS/BIO IMAGING SYSTEM）、分光光度計（BECKMAN DU80）。     1.3  引物、探針的設計與合成  引物序列：P1：5-GGCCTTCTTAAAGATTGGCTTCT-3；P2：5-GCCTCATAGACCGCACCAAC-3；PCR目的條帶長度為179bp。

12、TaqMan探針序列：5-FAM-CTGTCCA GGTGAGAAAG-MGB-3。引物和探針用Primer Premier 5.0軟件設計，引物由大連寶生物工程有限公司合成，探針由上海基康生物工程有限公司合成和修飾。     1.4  人外周全血單個核細胞分離及細胞總RNA提取  用淋巴細胞分離液密度梯度離心法，收集單個核細胞，用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取總RNA3。     1.5  RT-PCR  以1.25l總RNA為模板，以Random 9 mers為引物，逆轉錄反應體系10l。6

13、5 1 min，30 5 min，25 min內勻速升溫至65 ，65 20 min，98 5 min，5 5 min。25l PCR反應體系，含0.125l 5U/l Ex Taq，2.5l 10×Ex Taq Buffer，2l 25 mmol/L Mg2+，2l 2.5 mmol/L dNTP，0.5l 25mol/L 引物P1，0.5l 25moul/L引物P2，RT產物1l。95 5 min預變性；94 45 s，60 45 s，72 30 s，共35個循環；最后72 5 min延伸。     1.6  PCR產物純化、與pMD18-

14、T載體連接及轉化  用DNA凝膠回收試劑盒純化上述PCR產物，取純化產物1l、pMD 18-T載體1l、T4DNA連接酶1l、10×連接酶緩沖液1l，加無菌雙蒸水使總體積為10l。在16 下連接過夜。制備DH-5a感受態細胞，連接產物轉化DH 5，在氨芐青霉素平板上根據藍白斑試驗篩選陽性轉化菌。     1.7  重組質粒的提取及鑒定  取2 ml的菌液，用質粒DNA小量純化試劑盒提取重組質粒。PCR擴增：用PDGFB引物對重組質粒進行PCR檢測。EcoR/Hind 雙酶切反應：10l重組質粒，3l 10×酶切緩沖

15、液，1l EcoR酶液(10 U/l)，1l Hind 酶液(10 U/l)，15l雙蒸水，于37 水浴3 h。測序分析：取1 ml陽性轉化菌液送至大連寶生物工程有限公司進行測序，結果用blast軟件進行同源性分析。     1.8  重組質粒OD值的測定以及標準曲線的建立   取陽性重組質粒測A260，將重組質粒稀釋成不同濃度作為標準品進行熒光定量PCR檢測。25l PCR反應體系：含0.25l 5 U/l Ex Taq Hs，5l 5×Real Time PCR Buffer，0.5l 250 mM Mg2+，0.75l

16、 10 mmol/L dNTP，1l 25mmol/L引物P1，1l 25mmol/L引物P2，1l 25mmol/L探針，上述RT產物1l。擴增參數為：94 2 min預變性，95 15 s，60 30 s，40個循環。     1.9  熒光定量PCR檢測人PDGFB mRNA的臨床應用  由20例HBsAg陰性對照和20例HBsAg陽性患者中分離外周血單個核細胞，顯微鏡下計數，收集106個單個核細胞，提取總RNA，熒光定量PCR檢測人PDGFB mRNA的表達。     1.10  統計學處理方法&

17、#160; 采用SPSS13.0統計軟件數據包進行分析。HBsAg陰性對照和HBsAg陽性患者的PDGFB mRNA定量檢測用兩個獨立樣本t檢驗分析進行統計分析。     2  結果     2.1  重組質粒PCR擴增鑒定  以提取的重組質粒為模板，用PDGFB引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳可見179 bp的條帶（見圖1）。     2.2  重組質粒的限制性雙酶切反應鑒定  將重組質粒進行EcoR /Hind 雙酶切后進行瓊脂糖凝膠上電泳，有236

18、 bp條帶(包括179 bp的PDGFB cDNA和載體上的57 bp)(見圖1)。     2.3  重組質粒測序分析  用通用引物對重組質粒DNA進行測序，序列如下：GGCCTTCTTAAAGATTGGC TTCTTCCGCACAATCTCGATCTTTCTCACCTGGACAGGTCGC AGCTGCACCTGGGTGGGGCGGCACTGCACGTTGCGGTTGTTG CAGCAGCCGGAGCAGCGCTGCACCTCCACACAGGGCG GCCACACCAGGAAGTTGGCGTTGGTGCGGTCTATGAGGC，經blast

19、序列同源性分析，該序列為PDGFB cDNA序列，無堿基突變(參照序列號CU013426)。     2.4  重組質粒濃度計算  測260 nm 吸光度，結果為A260=0.613，A280=0.3346，A260/A280=1.8857。     重組質粒濃度C=A260×50×10-6/(N×340×2)×     6.02×1023(拷貝/ml)=0.18857×50×10-6/(2871×

20、;340×2)×6.02×1023=2.91×1012(拷貝/ml)     N為重組質粒的大小（脫氧核苷酸數量）。將重組質粒原液稀釋成1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/ml作為熒光定量PCR的標準品。     2.5  標準曲線的建立  1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝

21、/ml重組質粒作為標準品進行熒光定量PCR分析，熒光強度與循環數的關系見圖2，重組質粒濃度的對數與Ct值的關系見圖3，線性關系良好。     2.6  熒光定量PCR檢測人PDGFB mRNA的臨床應用     HBsAg陽性組PDGFB mRNA含量明顯高于HBsAg陰性組PDGFB mRNA含量，兩者差異具有顯著性。     3  討論     本研究采用T-A克隆法克隆PDGFB cDNA。首先從人單個核細胞中提取總RNA，用RT-PCR擴增PDGF

22、B cDNA。由于DNA聚合酶具有延伸酶活性，能在PCR產物3'端添加一個非模板依賴的核苷酸，這個核苷酸通常是脫氧腺苷酸（A）。pMD18-T 載體是一個3'端突出一個脫氧胸苷酸（T）的線性質粒，可直接與PCR產物連接，環化，轉化大腸桿菌DH-5，即可得到PDGFB cDNA重組克隆。T-A克隆法較一般的黏端克隆法更為簡捷方便。對目的基因重組克隆進行鑒定，一般采用限制性核酸內切酶消化、目的基因PCR擴增及對目的基因進行測序等方法。這三個方面實驗的結果均與目的基因片段完全吻合，由此證明已經成功克隆了PDGFB cDNA。     實時熒光定量PCR技

23、術是目前廣泛使用的定量檢測靶核酸的常用方法，PCR儀實時采集熒光信號，動態檢測擴增產物的聚積，保證在擴增的指數期獲得數據來進行定量分析。利用原始模板數的對數與Ct值（達到擴增閾值的循環數）的良好線性關系，可定量檢測原始模板數。該方法不但檢測準確、敏感、快速，而且閉管分析避免了PCR產物的污染，克服了常規PCR定性檢測且易污染的不足。已出現的熒光定量PCR方法有多種，其中應用前景最廣泛的方法是TaqMan技術。本研究所用TaqMan-MGB探針為3端標記了自身不發光的淬滅熒光分子，以取代常規可發光的Tamra熒光標記，降低了熒光本底，提高了分辨率；且探針3端結合了小溝結合物(minor groo

24、ve binder，MGB )，使得探針的Tm 值提高，大大增加了探針的雜交穩定性，提高了配對與非配對模板間的Tm值差異，使非特異性雜交顯著降低4。     本實驗建立的實時熒光定量PCR檢測人PDGFB mRNA，具有如下特點：靈敏度較高，結果最低檢測限為104拷貝/ml；特異性強，將TNF、HGF等PCR產物作為模板，進行實時定量PCR反應（反應里含PDGFB引物和探針），無擴增信號；線性范圍廣：在1051010拷貝/ml范圍內具有良好的線性，可以比較準確地測定PDGFB mRNA。     將建立的方法應用于臨床檢測，定量測定H

25、BsAg陰性組和HBsAg陽性患者PDGFB mRNA的含量，發現HBsAg陽性患者的PDGFB mRNA濃度比HBSAg陰性組的要明顯地高出幾十倍，提示PDGFB mRNA的含量與乙肝有密切的相關性，而乙肝與肝纖維化、肝硬化也有著密切的相關性。有文獻報道稱，PDGF能夠強烈刺激星狀細胞(HSC)的增殖和遷移，促使其膠原的產生和沉積，并誘導HSC合成轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等細胞因子，肝星狀細胞被激活后轉化為成纖維細胞，并合成分泌大量的細胞外基質，這些基質在肝臟大量地沉積，逐步形成肝纖維化5，6。   【參考文獻】  1Andrew JG, Hoyland JA, Freemont AJ, et al. Platelet-derived growth factor expression in normally healing human