1、動物營養學報 2011, 23(4:542-545Ch i nese Journa l o f Ani m a l Nu tr iti ondo:i 10. 3969/.j issn . 1006-267x . 2011. 04. 003骨骼肌特異性鈣蛋白酶與蛋白質降解張 勇 1鄧 科2(1. 沈陽農業 大學畜牧獸 醫學院 , 沈陽 110866; 2. 沈陽農業 大學生物科 學技術學 院 , 沈 陽 110866摘 要 :骨骼肌特異性鈣蛋白酶 ca l p ain -3是鈣蛋白酶系統的一員 , 與肌細胞生成和細胞凋亡密 切相關 , 同時也被認為參與了蛋白質降解過程 。 本文主要從骨骼肌特異性

2、鈣蛋白酶的結構功能 和生理活性 , 并結合近年來國際上的研究成果來分析骨骼肌特異性鈣蛋白酶在骨骼肌蛋白質降 解中的作用 。關鍵詞 :骨骼肌特異性鈣蛋白酶 ; 肌聯蛋白 ; 蛋白質降解 中圖分類號 :S811. 2 文獻標識碼 :A 文章編號 :1006-267X (2011 04-0542-04收稿 日期 :2010-11-11基金 項目 :國家自 然科學基金 /鈣蛋 白酶調控豬體蛋 白降解的信號途 徑研究 0(30972112作者 簡介 :張 勇 (1972 , 男 , 甘肅武 威人 , 教授 , 博士 , 碩士生 導師 , 主要從 事分 子營 養學 與飼料 資源 開發 利用 研究。 E-m

3、 ai:l s yndzhy . 骨骼肌特異 性鈣蛋 白酶 ca lap i n -3(又名 p94、 CAP N 3 是 鈣 蛋 白 酶 (calpain 的 一 種。 calpain -3并不是肌肉生 長所必 需的蛋 白酶 , 卻在 維護 肌肉 完整性中發揮了至關重要的作用。鈣蛋 白酶在骨 骼肌中主要存在于 Z 線處 , calpa i n -3在骨骼肌中與 肌聯蛋白 (titi n 緊 密結合 在一起。肌 聯蛋白 有將 粗肌絲與 Z 線相連 , 維持肌原纖維 (m yofibril 的完 整性和穩定性 的功能 , 同 時肌聯 蛋白和 伴肌 動蛋 白 (nebu lin 是 N 2線的 組

4、分。肌原 纖維 蛋白 質降 解的第 1步必須 是肌 原纖維 分解成 肌絲 , 超 微結 構研究表明 N 2線 是宰后 鈣蛋 白酶最 先降解 的結 構之一。因此本文依據近年來國際上的 研究來討 論 ca l p ain -3在骨骼肌中的功能和作用。1 骨骼肌特異性鈣蛋白酶的結構鈣蛋白酶主要由 2種廣泛存在的鈣蛋白酶 (u -b i q u itous ca l p ains L -鈣蛋 白酶 (L -calpai n 或 ca-l pain -1 、 m -鈣 蛋 白酶 (m-calpa i n 或 calpain -2 和 ca l p a i n -3組成。前二者都由 2個亞基組成 , 分子

5、量 相近 , 但二者表 現最高 活性所 需的鈣 離子 濃度 不同 , 前者為微摩爾級 (112L m o l/L, 后者為 毫摩 爾級 (250750L m oL /L,calpa i n -3與前二者結構 相似。通過不同來源的鈣 蛋白酶 c DNA 序列可 以 發現 , calpa i n -1和 ca lpa i n -3大亞 基均 由 4個 結 構 域組成 (圖 1, 二者均包含域 Ñ、 Ò、 Ó和 Ô, 域 Ñ是 N -末端域 , 域 Ò是蛋 白質水解的區 域 , 域 Ó的 功能未知 , 域 Ô是由 4個含

6、 E 、 F 的螺 旋 -環 -螺 旋結構 (EF -hand 組成的主要鈣離子結合域。 C a-l pain -3有 3個額外 的插入區域 , 即 NS 區、 前肽 IS1區和結合肌聯蛋白的 I S2區。圖 1 calpain -1和 calpain -3的結構示 意圖F ig . 1Schem a tic d i ag ram o f t he structure s o f ca l pain -1and ca l pa i n -3p ro te i ns4期 張 勇 等 :骨 骼肌特異 性鈣蛋白酶 與蛋白質降 解2骨骼肌特異性鈣蛋白酶的活性研究表明 , 全長度的 calpain -3

7、是沒有活性 的 , 它必須自溶 (即水解自身 刪除前肽 I S1區以獲得 活性 (圖 1 1。該 自 溶 過 程 需 要 鈣 離 子 的 參 與 2。自溶后 , 獲得 1個可以 與底 物和 抑制 劑結 合的酶活性位點 3。通過蛋白質 電泳與免疫印跡 試驗 4, 可以觀察到自溶后全長度為 94ku 的蛋白 質 , 依據鈣離子濃度和 時間不同 , 可進一 步分解成 60、 58和 /或 55ku 的產物 (用抗 體定 向到 IS1區 C 端 。 calpain -3在 體 內 最 初 是 以 它 的 降 解 形 式 (即有活性形式 被 發現的 , 它 在轉錄 后會立 刻自 溶 , 因此難 以提取

8、5, 目前有 研究顯 示 , 在一 段時 間內 , 與 ca l p ain -1相比 , calpain -3在骨骼肌細胞中 低鈣離子濃度下 (2. 5L m ol/L更穩 定 4-6。與廣 泛存在的鈣蛋 白酶不 同的是 , 內 源性鈣 蛋白 酶抑 制蛋白 (ca lpastain 及 其他的 外源性 抑制 劑 , 如亮 肽酶素和鈣蛋白酶抑制劑 Ñ和 Ò等對 ca l p a i n -3的 I S1區裂解是沒有抑制效果的 3。另外 , 除了通過分子內和分 子間方法自溶 外 , calpa i n -3還沒有其 他明確 的內 源性底 物 3-7。通 過確定 calpa i

9、 n -3的生理學 底物來說明它在骨骼肌 中的 生理 作 用 是很 重 要 的。 應該 指 出 的是 , ca-l pa i n -3水解的目的可能不是參與一個降解過程 , 而 可能是一個根據底物的功能不同在一定 程度上進 行的不可逆的調 節過程 7。如 在 2A 型肢帶 肌營 養不良癥 (LG M D2A 中 , 肌 肉營 養不 良的 癥 狀可 能是因為肌節重塑失調 , 這也可以歸結于缺乏 ca-l pa i n -3的蛋白質水解 底物 8。很多 蛋白質在 體外 試驗中被證 明可能 是 calpain -3的底 物 , 但在 體內 還沒有 被證 明。這些 底物 包括 肌 原纖 維 /Z線 蛋

10、 白、 肌聯蛋白 (在 PEVK 區 , 與 N 2A 線相鄰 、 肌動 蛋白 C 和肌球 蛋白輕鏈 1等 , 支持 calpa i n -3在肌 節重塑中發 揮作用 9。但有研 究發 現 , 鈣蛋 白酶 抑制蛋白也可以在體外裂解 calpa i n -3, 而在體內卻 暫未發現這種 現象 , 所以 那些經 過體外 驗證 的底 物在體內是否也會有相同的作用仍有待驗證 10。 最新研 究 指出 , calpain -3的 mRNA 豐 度與 蛋 白質表達量間可能是沒有相關性的 , 因此 , 研究在 體內全長度表達的 ca lpa i n -3, 必須通過更多的蛋白 質水平上的試 驗 , 獲 得與

11、 生理功 能相關 的數 據后 才能準確進行 11-12。 3骨骼肌特異性鈣蛋白酶的功能和作用 ca l p ain -3可 能 在 肌 肉 修 復 和 維 護 中 起 作 用 13, 同時它也被指出參與了肌細胞生成 14和細 胞凋亡 15-16。 ca l p ain -3是肌 肉成熟 的關鍵 , 生 理 學研究顯示 , 如果它不存在或不起作用 , 那么人 會 在 2040歲時患上 LGMD2A 17。因此 , 假定與此 病相關的鈣蛋白酶都 被降解和破壞 , 而人在 10歲 前不會 患上 LGM D2A, 那 么 ca l p a i n -3就不 可能 是 正常肌肉生長所必需 的蛋白質 ,

12、確切來 說 , 它在 維 護肌肉完整性中有至關重要的作用 13。有試驗證 明 , 在肌肉細胞培養中 , 只有在成肌細胞增殖和 融 合后 , 全長 度 的 ca l p a i n -3才 開始 表 達 18。另 外 , 在轉基 因小 鼠的 ca l p ain -3過 量表 達 19和 小鼠 骨 骼肌中缺乏 calpa i n -320這 2個試驗中均不出 現明 顯疾病癥狀 , 而人類疾病脛骨肌萎縮癥 (LGMD2J 在實驗小鼠上表現的癥狀 為肌營養不良癥與肌 炎 (MDM 21, 由 calpain -3與 N2A 在肌 聯 蛋白 上 的 結合位點相 鄰域的 基因 突變造 成。在 MDM 小

13、 鼠 中 , 降低 calpa i n -3表達濃 度 21和使 calpa i n -3表 達 過量 22卻會導致更嚴重的肌肉營養不良癥狀。根 據這些研究結果 , 有人猜測 , calpa i n -3的活性可 能 通過它 與肌 聯蛋 白在 N 2A 線的 連接 位 點而 被 調 控 22, 這也許可以合理 解釋 calpain -3轉基因動 物 的健康狀況。此外 , calpain -3已被證明通過調節核 因子 I J B A 參與了細胞凋亡 16-23。4骨骼肌特異性鈣蛋白酶與蛋白質降解 蛋白質降 解 的 主要 調 節 途 徑有 鈣 蛋 白 酶 系 統、 溶酶體途徑、 線 粒體蛋 白酶系

14、 統、 泛素 -蛋 白 酶體途徑、 胞液蛋白酶水解途徑 , 但鈣蛋白酶參 與 肌原纖維蛋白質降解卻是 蛋白質降解過程中的 限 速步驟 , 也是家 畜屠宰 后早期 發生肌 肉嫩 化的 主 要特征。肌原纖維蛋白質降解 的第 1步必須是 肌 原纖維分解成肌絲。肌聯蛋白 是一 個大 型的 肌節 蛋白 , 主 要存 在 于心肌細胞和骨骼肌細胞中 24-25。肌聯蛋白的 N 端錨定在 Z 線 , C 端綁定 粗肌絲 , 因此具有維持 肌 原纖維的 完整性 和穩 定性的 功能。同 時 , 肌聯 蛋 白和伴肌動蛋白是 N 2線的組 分 , 超微結構研究 表 明 , N 2線 是 宰 后 鈣 蛋 白 酶 最 先

15、 降 解 的 結 構 25-26543動 物 營 養 學 報 23卷calpa i n -3與肌聯蛋白緊密結合在一起 , 且其與 N 2A 線的 連接 位點 有可 能調節 它的 活性。同 時 , 雖然尚未被體內試驗證明 , 然而在體外試驗中 , 肌 原纖維 /Z線蛋 白、 肌聯 蛋白等均 是 calpai n -3的底 物。根據這 些可以 猜測 , 在鈣 蛋白 酶參 與的 肌原 纖維蛋白質 降解過 程中 , 全長 度的 ca l p a i n -3受到 鈣離子濃度和 它與肌 聯蛋白 結合位 點的 調控 , 降 解成 94ku 的活性形 態 , 并 參與肌動 蛋白質降 解 , 促進粗肌絲的釋放

16、 , 從 而加速蛋白質降解過程 , 與 此同時 , 鈣蛋 白酶的 其他 成員也 會降解 肌原 纖維 的肌節 , 釋放肌絲并降 解為小片段 , 然后 被溶酶體 所捕獲而進一步降解。但肌原纖維在體 內是否仍 為 ca l p ain -3的底物及 calpa i n -3與肌聯蛋白結合位 點的調控機制 不明 , 因此 具體情 況仍需 要再 通過 試驗來進行驗證。5小 結骨骼肌生長速度最終 取決于骨骼肌 細胞的數 量、 肌肉蛋白質合成和降解速度。激素注射、 飼料 添加劑的使用、 營養 狀況 和飼養 管理等 都能 通過 調節以上 3個基本因素而影響整體蛋白質的沉積速 度 , 從而影響肌肉生長速度。至今

17、為止 , ca l p ai n -3已 被發現有 20余年 , 仍沒有對其生理功能 的明確闡 述 , 而國際上 對其研 究主 要集中 于它本 身的 生理 結構及其與肌 肉運動 和營養 相關的 功能 , 很 少有 針對其在肌肉蛋白質降解方面的 研究。曾有試驗 研究通過調整飼料中的蛋白質水平和改 變飼養方 法來 影 響 鈣 蛋 白 酶 的 表 達 量 , 從 而 提 高 肉 品 質 27-28, 但主要集中于廣 泛存在的鈣蛋 白酶和其 內源性抑制劑 , 對 calpa i n -3的 研究卻不多。因 此 , 若能明確 ca l p a i n -3在蛋白 質降解過程中所起的作 用并對其調控 ,

18、從而提 高肉品質 , 必定能 夠提高畜 牧業的生產效 益 , 也 會為 鈣蛋白 酶系統 的研 究提 供大量的科學數據。參考文獻 :1REY M A, DAV IES P L. T he pro tease core o f the m usc le -spec ific ca lpa i n , p94, undergo es Ca 2+-de -pendent intra m o lecu l a r auto lysis J .F ebs L etters , 2002, 532:401-406.2GAR CI A D B E , GAUTH IER S , D av ies P L .

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