1、主要(zhyo)內容文庫(wnk)篩選法圖位克隆技術轉座子標簽法基因差異表達技術同源序列法基因芯片技術第1頁/共93頁第一頁，共94頁。第一節 文庫(wnk)篩選園藝植物基因組文庫的構建(u jin)園藝植物cDNA文庫的構建(u jin)目的基因的篩選第2頁/共93頁第二頁，共94頁。一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建(一)基因文庫的定義及類型1.定義 一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。2. 類型 基因組文庫: 植物基因組全部DNA片段組成(z chn)的基因文庫,反映基因組的全部遺傳信息。 cDNA文庫: 將某一特定組織表達的mRNA反轉錄成cDNA組成(z chn)的基因文庫，

2、每個克隆只含1種mRNA信息,足夠數目克隆則包含細胞全部mRNA信息。 cDNA便于克隆和大量擴增,不像基因組DNA含有內含子很難表達。第3頁/共93頁第三頁，共94頁。一、園藝植物基因組文庫(wnk)的構建(二)構建的植物基因組文庫需要滿足的條件 文庫能夠覆蓋整個基因組; 插入的DNA片段(pin dun)比較大; 文庫易于保存且較穩定第4頁/共93頁第四頁，共94頁。一、園藝植物基因組文庫(wnk)的構建(三) 載體的制備(zhbi)1.完整的基因組文庫所需要篩選的重組子數目N=In(1-P)/In(1-f)N,重組子的數量;P,所要求的概率;f,某一插入片段與相應生物基因組大小的比值.要

3、以的概充獲得番茄基因組(9.5108bp)20kb的插入片段,所需要篩選的重組子數為:N=In(1-0.99)/In1-(2104/9.5108)=2.2105第5頁/共93頁第五頁，共94頁。2. 載體的選擇a)質粒載體可承載15kb DNA左右片段(pin dun)(有效范圍為10kb)b)載體可承載25kb DNA左右片段(pin dun)(有效范圍為15kb)c)Cosmid載體可承載45kb DNA左右片段(pin dun)(有效范圍為40kb)一、園藝植物基因組文庫(wnk)的構建第6頁/共93頁第六頁，共94頁。 3.載體制備 要求:純度高,去磷酸效果好 去磷酸化是為了提高載體和

4、目標片段的連接效率 純度如果不高則會在重組克隆中含有大量的細菌基因組DNA,影響文庫(wnk)的質量.一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建第7頁/共93頁第七頁，共94頁。(四) 大片段基因組DNA的制備要求:一般提取的DNA相對分子量至少應該(ynggi)是文庫最終平均插入片段長度的3-5倍如插入片段達到100kb以上,則要求提取的基因組DNA 分子量要達到500kb以上實踐證明:提取的基因組DNA分子量越大,得到的重組克隆的插入片段越大一、園藝植物基因組文庫(wnk)的構建第8頁/共93頁第八頁，共94頁。基因組DNA 的不完全酶切1. 根據實驗需要選擇合擇的限制性內切酶1) 四個識別

5、位點的限制酶出現的幾率:1/2562) 六個識別位點的限制酶出現的幾率:1/40962. 分離目的酶切片段大小的確定(qudng)1)克隆單個基因:10kb2)克隆基因族:20kb一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建第9頁/共93頁第九頁，共94頁。基因組DNA 的不完全酶切3. DNA不完全酶切條件(tiojin)的確定1) 確定限制酶用量,改變酶切時間2) 固定酶切時間,改變限制酶的用量一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建第10頁/共93頁第十頁，共94頁。DNA的不完全(wnqun)酶切第11頁/共93頁第十一頁，共94頁。(五)大片段DNA(酶切片段)與克隆載體連接(linji

6、)1. 酶切片段的分離與純化1)低熔點瓊脂糖回收目的片段2)試劑盒回收目的片段一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建第12頁/共93頁第十二頁，共94頁。(五)大片段DNA(酶切片段)與克隆載體連接2.克隆載體連接連接體系中的四種連接方式: 載體自連; 載體和基因組DNA片段連接;基因組DNA片段的自連和基因組片段之間連接只有基因組DNA和載體之間的連接才是所需要的,如何提高(t go)它們之間的連接效率是連接反應的關鍵.可以通過調整載體與基因組DNA的比例來達到較好的效果.(載體與外源片段的比例為1:5-1:15)一、園藝植物基因組文庫(wnk)的構建第13頁/共93頁第十三頁，共94頁。

7、基因組DNA片段(pin dun)3凹端的不完全補平的策略第14頁/共93頁第十四頁，共94頁。 (六)載體的遺傳轉化 電轉化是轉化大腸桿菌使用最普通的一種(y zhn)手段 插入片段越大，轉化效率越低 (七)克隆的挑取、驗證 從文庫中隨機挑選一定量的克隆，搖菌，提取質粒DNA，酶切脈沖電泳檢查插入片段的大小，并根據數目計算空載率。 細胞器DNA的污染會降低文庫的實際容載量，一般用線粒體和葉綠體的探針對文庫進行檢測。一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建第15頁/共93頁第十五頁，共94頁。(八) 文庫的擴增、分裝(fn zhun)及保存1.基因組DNA文庫的保存1)影印濾膜保存法一、園藝(

8、yuny)植物基因組文庫的構建第16頁/共93頁第十六頁，共94頁。 (八) 文庫的擴增、分裝及保存 2.文庫在液體培養基中擴增保存 1)從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉入含適當的抗生素培養基中，混合的細菌生長數代后，其培養物于-70儲存(加終濃度為25%的甘油). 缺點:因文庫菌落生長的不均勻性而導致文庫中某些(mu xi)特定的序列過多或過少.一、園藝(yuny)植物基因組文庫的構建第17頁/共93頁第十七頁，共94頁。(八) 文庫的擴增、分裝及保存2.文庫在液體培養基中擴增保存2) 從平板上挑選單個克隆子接各種于合適的含抗生素的培養基中，菌體生長到一定濃度后，加入( jir)終濃度為2

9、5%的甘油，于-70或-25 下保存缺點：需要保存的克隆子數過多，工作量大一、園藝植物基因組文庫(wnk)的構建第18頁/共93頁第十八頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建 真核生物基因組DNA十分龐大,其復雜程度是mRNA的100倍左右，而含有大量的重復序列。采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發材料直接克隆目的基因的一個主要困難。高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時間階段(jidun)的單個細胞或個休中，都只有15%左右的基因得以表達，產生約15000種不同的mRNA分子。可見，由mRNA出發的cDNA克隆,其復雜程度要

10、比直接從基因組克隆簡單得多.第19頁/共93頁第十九頁，共94頁。二、園藝(yuny)植物cDNA文庫的構建(一)普通cDNA文庫的構建純化mRNA樣品的制備 選擇特定發育階段的特定組織為分離mRNA的材料。 mRNA的純化：利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴與olgo(dT)互補雜交,使mRNA固定在固相介質上,再將mRNA洗脫下來,制備出純屬化的mRNA樣品. mRNA樣品完整性的檢測:根據28S和18S rRNA電泳條帶的亮度判斷RNA的完整性，從而間接地判斷mRNA的完整性。 如果28S rRNA條帶的亮度是18S的2倍,RNA樣品完整。 如果2條帶的亮度反過來，說明(shumn

11、g)RNA樣品部分降解。 如果無清晰的條帶，說明(shumng)RNA樣品已經嚴重降解。第20頁/共93頁第二十頁，共94頁。mRNA純化(chn hu)第21頁/共93頁第二十一頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建(一)普通cDNA文庫的構建2. cDNA第一(dy)鏈的合成關鍵是獲得大量完整的cDNA拷貝影響因素：模板mRNA的質量、反轉錄酶、引物。反轉錄酶：禽源(AMV)和鼠源反轉錄酶(M-MuLV)。 AMV：除具有DNA聚合酶活性外，還有很強的Rnase H酶活性。 M-MuLV: Rnase H活性比AMV低,但反轉錄效率比AMV低。 Superscript反轉錄

12、酶:除去了MMLV的Rnase H活性,更能保證cDNA第一(dy)鏈的全長和高產。引物常用oligo(dT)和隨機六聚體核苷酸。第22頁/共93頁第二十二頁，共94頁。二、園藝(yuny)植物cDNA文庫的構建(一)普通cDNA文庫的構建3. 雙鏈cDNA的合成自身引導合成法利用(lyng)新合成的單鏈cDNA 3末端反轉所形成的發夾的雙鏈部分作為引物，引導DNA聚合酶以cDNA為模板，合成互補的第二鏈cDNA，反應結束后，用S1核酸酶降解發夾環的單鏈部分，即可得到雙鏈的cDNA片段。 主要缺點是在用S1核酸酶去除發夾環時的反應條件要求極為苛刻，難以控制，目前已極少采用。第23頁/共93頁第

13、二十三頁，共94頁。第24頁/共93頁第二十四頁，共94頁。二、園藝植物cDNA文庫(wnk)的構建 (一)普通cDNA文庫的構建 3. 雙鏈cDNA的合成 置換合成法 利用Rnase H將雜交雙鏈中的mRNA降解,形成多段仍與cDNA第一鏈保持雜交的RNA片段. 利用這些RNA片段作為引物,引導合成第二鏈cDNA. 隨著合成產物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作為引物的RNA片段均被新合成的互補鏈所置換. 通過DNA連接酶作用,將各段互補鏈連接成完整DNA鏈。 除去殘存的5末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3端突出的單鏈cDNA,得到一個雙鏈形式的cDNA片段. 該方法直接利用第一

14、鏈反應產物,避免了中間(zhngjin)處理和純化過程造成的cDNA損失,是目前合成cDNA第二鏈的常用方法.第25頁/共93頁第二十五頁，共94頁。第26頁/共93頁第二十六頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建(一)普通cDNA的合成3. 雙鏈cDNA的合成同聚物引導法在第一鏈的3端用末端轉移酶加上一段同聚體dG。以oligo(dC)為引物合成第二鏈.該法最大的缺點是獲得的cDNA5端上游有一段dG:dC殘基,可能(knng)會抑制表達過程中DNA的轉錄.但該法在最佳條件下可高交克隆mRNA的5端序列.第27頁/共93頁第二十七頁，共94頁。第28頁/共93頁第二十八頁，共

15、94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建(一)普通cDNA文庫的構建4. 雙鏈cDNA的克隆cDNA的修飾為了(wi le)提高雙鏈cDNA片段與載體的連接效率,需要對cDNA進行修飾,即給平端的雙鏈cDNA片段添加銜接頭。所謂銜接頭是人工合成的含有限制酶酶切位點的短雙鏈DNA片段，或者一端為限制酶粘性末端的雙鏈DNA片段。用前一種銜接頭連接后，為了(wi le)避免限制酶對cDNA片段內部可能出現的酶切位點的切割,在添加銜接頭之前,文庫cDNA需經甲基化酶處理。添加后一類型的銜接頭時，不必對文庫cDNA進行修飾.第29頁/共93頁第二十九頁，共94頁。合成(hchng)接頭和銜接頭第

16、30頁/共93頁第三十頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建 (一)普通cDNA文庫的構建 4. 雙鏈cDNA的克隆 cDNA的克隆 將制備的cDNA成功克隆到載體中去的關鍵問題是cDNA和載體的比例. 必須尋找一個適當的比例以避免單個重組體中含有多個串聯cDNA分子或產生過高的非重組背景. 為提高連接反應效率,可在連接混合物中加適量(shling)PEG 8000. 建成的cDNA文庫一般應進行效價測定并擴增,以利多次篩選并長期保存.第31頁/共93頁第三十一頁，共94頁。cDNA文庫構建(u jin)流程示意圖第32頁/共93頁第三十二頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)c

17、DNA文庫的構建(一)普通cDNA文庫的構建6. 普通cDNA文庫存在的主要不足低豐度表達序列在文庫中出現的幾率很低,要想得到低豐度表達基因,至少要篩選106個克隆.構建普通cDNA文庫所需的mRNA量比較大,達到數微克.篩選普通cDNA文庫的工作(gngzu)復雜,需要很長時間,限制了基因克隆的速度.第33頁/共93頁第三十三頁，共94頁。二、園藝(yuny)植物cDNA文庫的構建 (二)新型cDNA文庫的構建(u jin) 1. PCR介導的cDNA文庫 原理: 以cDNA第一鏈為模板,設計一組引物,通過PCR擴增獲得多拷貝雙鏈cDNA。 優點：增加低豐度mRNA的克隆機會;利用僅有的幾個

18、細胞或微量的mRNA建立較大的cDNA文庫。 缺點：PCR合成的片段一般較短，大片段的全長擴增困難；擴增過程中錯誤摻入率甚高；由于PCR對短片段的擴增效率高于長片段，故mRNA的原始豐度難以在文庫中體現。 應用：適合于克隆來源困難的組織或細胞的基因。第34頁/共93頁第三十四頁，共94頁。 (二)新型(xnxng)cDNA文庫的構建 2. 標準化cDNA文庫 定義:某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中,且含量相等的cDNA文庫。 優點： 增加了克隆豐度極低的mRNA的機會。 能發現普通cDNA探針所不能發現的稀有轉錄區。 能估計大多數基因的表達水平，并發現組織特異性基因。 二、園藝植物c

19、DNA文庫(wnk)的構建第35頁/共93頁第三十五頁，共94頁。二、園藝(yuny)植物cDNA文庫的構建 (二)新型cDNA文庫的構建 2. 標準化cDNA文庫 構建方法 用基因組DNA做選擇(xunz)雜交,所捕獲的cDNA豐度與對應的基因組DNA豐度一致,其缺點是約20%的非單一拷貝基因在構建的文庫中豐度偏高。 根據cDNA退火的二級動力學特征，即稀有拷貝的cDNA較豐度拷貝的cDNA復性或雜交慢,使未復性部分的單鏈cDNA漸趨等化。第36頁/共93頁第三十六頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建 (二)新型cDNA文庫的構建 3. 染色體或區域特異性cDNA文庫 用某

20、一染色體或基因組區DNA與合成的cDNA池或已構建的cDNA文庫雜交(zjio),將捕獲的cDNA進行PCR擴增,便可構建染色體或區域特異性cDNA文庫。 其中的cDNA或定位于該染色體上或與之有同源性。 染色體顯微切割技術的發展使得構建的文庫更狹窄，更具特異性。 第37頁/共93頁第三十七頁，共94頁。二、園藝植物(zhw)cDNA文庫的構建 (二)新型cDNA文庫的構建 4. 消減cDNA文庫 又稱差示文庫,常用于克隆不同(b tn)組織或同一組織在不同(b tn)的生理狀態下表達有差異的基因. 在一定條件下用過量不含目的基因的驅動(driver)與含有目的基因的試驗方(tester)進行

21、雜交,將含有目的基因的未雜交部分收集后構建相應的文庫。 由于消減cDNA文庫的富集作用,使所需篩選的克隆數減少幾十到上百倍.第38頁/共93頁第三十八頁，共94頁。基因組DNA文庫(wnk)與cDNA文庫(wnk)的比較第39頁/共93頁第三十九頁，共94頁。基因組DNA文庫(wnk)的優點相對于cDNA文庫(wnk), 基因組文庫(wnk)的優點:cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結構,沒有包括基因組的間隔序列;cDNA文庫(wnk)中, 不同克隆的分布狀態總是反映著mRNA的分布狀態,即:高豐度mRNA的cDNA克隆,所占比例較低,分離基因困難;從cDNA克隆中,不能克隆到基因組DNA中

22、的非轉錄區段序列，不能用于研究基因編碼區外側調控序列的結構與功能。第40頁/共93頁第四十頁，共94頁。cDNA文庫的主要(zhyo)優點cDNA文庫以mRNA為材料,特別適用天某些mRNA病毒等的基因組結構研究及有關基因的克隆分離.cDNA文庫的篩選比較簡單易行。每一個cDNA文庫都含有一種mRNA序列,這樣在目的基因的選擇中出現假陽性的概率(gil)就會比較低,因此,陽性雜交信號一般是有意義的,由此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因.cDNA文庫可用于在細菌中能進行表達的基因的克隆,直接應用于基因工程操作. cDNA克隆還可用于真核細胞mRNA的結構和功能研究.第41頁/共93頁第四十一頁

23、，共94頁。cDNA克隆的主要(zhyo)缺點 cDNA文庫所包含的遺傳信息要遠遠少于基因組DNA文庫,并且(bngqi)受細胞來源或發育時期的影響。 cDNA文庫雖能反映mRNA的分子結構和功能信息,但不能直接獲得基因內含子序列和基因編碼區外大量調控序列的結構與功能方面信息。 在cNDA文庫中,相應于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高,分離起來比較容易,而相應于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低,因此,分離也就比較困難。第42頁/共93頁第四十二頁，共94頁。三、目的基因(jyn)的篩選 1. 根據目的基因的核苷酸序列篩選 根據基因序設計引物,以基因組DNA或mRNA反

24、轉錄的cNDA為模板進行PCR擴增.如果得到的只是基因部分序列,可以將其克隆至載體,作為探針篩選cDNA文庫(wnk)和基因組文庫(wnk)獲得全長基因. 用探針直接篩選庫,若能得到其它植物已分離的相關基因,則可以直接用作探針篩選cDNA文庫(wnk)和基因組文庫(wnk),獲得研究植物的目的基因.第43頁/共93頁第四十三頁，共94頁。三、目的基因(jyn)的篩選 2. 根據目的基因的核苷酸序列篩選 如果已知基因表達產物(蛋白質)的氨基酸序列,就可以反推出原來基因的核苷酸序列。 從N端對10多個連續的氨基酸進行序列測定，選擇連續6個以上簡并程度最低的氨基酸，按各種可能的序列結構合成寡核苷酸探

25、針庫，從cDNA文庫和基因組文庫中篩選全長的基因. 缺點:在實驗中得到純度高、數量足夠的目的基因表達產物(蛋白質)是很困難的,蛋白質測序也花費(hufi)較高,難度較大.第44頁/共93頁第四十四頁，共94頁。三、目的(md)基因的篩選 3. PCR法篩選基因文庫 將基因文庫分裝96孔培養板. 培養一段時間后，分別(fnbi)從同一行或同一列孔中吸取少量培養物合并。 以此混合物為模板進行PCR擴增，根據凝膠電泳的結果判定相應行或列混合孔中是否含有陽性克隆。 對含有陽性克隆的行或列孔中培養物再次分裝，經培養后進行第二輪PCR擴增。 如此反復操作，直至獲得陽性克隆。第45頁/共93頁第四十五頁，共

26、94頁。第二節 圖位克隆技術一、分離基因( jyn)的程序二、優缺點第46頁/共93頁第四十六頁，共94頁。一、分離(fnl)基因的程序 (一) 圖位克隆技術的定義及原理 定義:根據目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法. 原理:首先找到一個是以與目標基因相連的DNA分子標記,然后通過染色體步移技術克隆分離出目標基因. 當基因與標記之間的距離小于基因組文庫中克隆的平均(pngjn)插入片段大小時,就要可直接篩選到含有目標基因的克隆,這種方法稱為染色體登陸(chromosome landing )第47頁/共93頁第四十七頁，共94頁。一、分離基因(jyn)的程序(二) 分離基因的程序(

27、chngx)目的基因的初步定位 利用分子遺傳圖譜確定與目的基因連鎖的分子標記。目的基因區域的物理作圖 將分子標記之間的遺傳距離（cM）轉化為物理距離(堿基數),構成該基因區域的物理圖譜.構建并篩選含有大插入片段的基因組文庫. 用與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選大片段基因組文庫，獲得陽性克隆。第48頁/共93頁第四十八頁，共94頁。一、分離(fnl)基因的程序(二) 分離基因的程序構建目的基因區域跨疊克隆群 以陽性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫，獲得含有目標基因兩側(lin c)分子標記的大片段跨疊群目的基因的精細定位和染色體登陸 以目標基因兩側(lin c)的分子標記為探針，通過染色體登陸

28、獲得含目標基因的陽性克隆。外顯子的分離和鑒定 利用篩選cDNA文庫,外顯子捕捉等技術獲得候選基因，通過功能互補實驗確定目標基因。第49頁/共93頁第四十九頁，共94頁。第50頁/共93頁第五十頁，共94頁。第51頁/共93頁第五十一頁，共94頁。第52頁/共93頁第五十二頁，共94頁。二、優缺點主要應用(yngyng)于基因組較小、分子標記連鎖圖密度較高和轉化系統比較穩定成熟的植物。對于基因組較大，重復序列較多的園藝植物，圖位克隆法要步移大量的DNA片段，投資大，效率低；而DNA大片段插入文庫含有許多嵌套克隆或克隆后的重排現象等原因，使得染色體步移十分困難。 對于這些植物，可以通過構建高密度的

29、分遺傳圖譜和尋找物理距離目的基因很近的分子標記，使得染色體步移的距離大大縮小。第53頁/共93頁第五十三頁，共94頁。第三節 轉座子標簽(bioqin)法 一、轉座子的分類 二、分離(fnl)基因的程序 三、優缺點 四、T-DNA標簽法第54頁/共93頁第五十四頁，共94頁。一、轉座子的分類(fn li)（一）轉座子的定義與功能1. 定義染色體上一段可以移動的DNA序列，可以從一個基因( jyn)座位轉移到另一個基因( jyn)座位。2. 功能當轉座子插入到某個功能基因( jyn)的內部或鄰近位點時，就會使插入位置的基因( jyn)失活并誘導產生突變型；而當轉座子切離時，又使目的基因( jyn

30、)恢復活性。第55頁/共93頁第五十五頁，共94頁。一、轉座子的分類(fn li)（二）轉座子的分類1。DNA轉座子通過DNA復制和直接切離兩種方式(fngsh)獲得可轉移片段，重新插入基因組DNA中。2。反轉錄轉座子由RNA介導的轉座子，即作為DNA的轉座子首先被轉錄為RNA，再借助反轉錄酶反轉錄合成DNA，插入到新的染色體位點來實現轉座過程的。第56頁/共93頁第五十六頁，共94頁。二、分離(fnl)基因的程序采取農桿菌介導等適當轉化方法反轉座子導入目標植物，設法(shf)將轉座子插入到目標基因內部或鄰近位點，引起表型突變。通過表型篩選獲得純合突變株。構建純合突變株的核基因組文庫。以轉座地

31、子片段作為探針，從該基因組文庫中篩選含轉座子片段的克隆。以該克隆作探針，篩選另一正常植株的核基因組文庫，獲得完整的正常目的基因。第57頁/共93頁第五十七頁，共94頁。第58頁/共93頁第五十八頁，共94頁。三、優缺點 優點：利用轉座子標簽法可在不了解基因產物的生化性質和表達模式的情況下分離植物(zhw)基因。 局限性 該技術的前提條件是要篩選出轉座子插入的突變體。在實際操作中，由于轉座頻率往往很低，因此，需要篩選的突變體群體較大。 對于那些須在特定環境或特定發育階段才有突變表型的基因，往往由于看不到明顯的突變表型而被忽略。 由于基因的功能補償等機制的作用，即使有些基因產生了插入突變，也可能看

32、不到突變表型，因而不能運用該方法。第59頁/共93頁第五十九頁，共94頁。T-DNA標簽(bioqin)法 原理：T-DNA能夠從農桿菌中轉移并穩定地整合到植物宿主的基因組中，從而使整合位置上的基因失活或產生突變，通過T-DNA上的標記基因（如GUS等基因）就可檢測突變位置，得到與T-DNA相連的DNA片段，以此制備探針篩選野生型基因文庫，就可得到與突變相應的完整基因。 缺點 由于T-DNA的可移動性，不易獲得較穩定的突變遺傳系。 由于高等植物基因組中大量的重復序列(xli)存在，也降低了獲得目標突變體的效率，實驗周期較長。第60頁/共93頁第六十頁，共94頁。第四節 基因差異(chy)表達技

33、術一、mRNA差異顯示技術二、抑制性消減雜交技術三、代表性差異分析法四、基因( jyn)表達系列分析五、cDNA-AFLP技術第61頁/共93頁第六十一頁，共94頁。一、mRNA差異(chy)顯示技術1. 原理 根據大多數真核細胞mRNA的3端具有poly(A)結構,利用含oligo(dT)的寡聚核苷酸作為引物，將總mRNA反轉錄(zhun l)為cDNA,然后通過PCR技術和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異cDNA片段,從而篩選出目的基因.第62頁/共93頁第六十二頁，共94頁。一、mRNA差異顯示(xinsh)技術 2. 基本步驟 從不同植物或組中提取總mRNA. 用oligo(dT)12M

34、N為引物(其中,M=G/C/A,N=G/C/T/A),在反轉錄酶的作用下,將mRNA反轉錄成 cDNA. 用與反轉錄相同的錨定引物和由10個堿基組成的隨機引物對生成的cDNA進行PCR擴增. PCR擴增產物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在相鄰泳道(yn do)上分析,找到差異表達的cDNA條帶. 加收差異表達的條帶,將其作為探針進行Northern雜交或篩選cDNA文庫,獲得差異表達的基因全長.第63頁/共93頁第六十三頁，共94頁。第64頁/共93頁第六十四頁，共94頁。一、mRNA差異顯示(xinsh)技術 3. 優缺點 優點 在基因序列未知的情況下，直接用來鑒定和克隆差異表達基因，具有簡便，

35、快速，RNA用量少，效率高等優點。 主要用于比較(bjio)兩種以上特定生理狀態或不同發育階段的mRNA樣品間基因表達的差異. 缺點 假陽性特別高，可達70%，增加了后續工作的難度。 由于PCR的敏感性，mRNA差異顯示技術重復性較差. 擴增片段較小(110-500bp),不能代表差異表達的基因. 只能擴增靠近Poly(A)mRNA3端不大于600bp的區域。 對高拷貝mRNA有較強的傾向性，不能用于低拷貝的mRNA.第65頁/共93頁第六十五頁，共94頁。二、抑制性消減雜交(zjio)技術 1. 原理(yunl) 以抑制PCR為基礎的cDNA消減雜交. 所謂抑制PCR是利用非目標基因片段兩端

36、的長方向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構，無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。第66頁/共93頁第六十六頁，共94頁。二、抑制性消減(xio jin)雜交技術 2.基本步驟 提取含有目的基因的待測組織(tester)和不含目的基因的對照組織(driver)的mRNA,并反轉錄為cDNA. 用限制性內切酶將兩種不同的cDNA切割為小片段. 將test cDNA分為(fn wi)兩份,分別連接不同的接頭。 用過量的driver cDNA分別與這兩種test cDNA進行第一次消減雜交,會產生:單鏈tester,雙鏈tester/tester,雙鏈tester/driv

37、er,單鏈driver及 雙鏈driver/driver第67頁/共93頁第六十七頁，共94頁。二、抑制性消減雜交(zjio)技術 2. 基本步驟 混合兩份雜交樣品,并加入新的變性driver cDNA進行第二次消減雜交,從而形成一種新的雜交組分,即分別含有不同接頭的雙鏈cDNA分子(tester-adaptor 1/tester-adaptor 2). 補平變性后分子的黏性末端. 以接頭1和接頭2序列為引物對其進行第一輪PCR。 用與接頭內側序列互補的另一對引物進行第二輪PCR，富集差異表達的目的基因片段。 用第二輪PCR產物構建(u jin)相應的差減cDNA文庫，克隆差異表達基因。第68

38、頁/共93頁第六十八頁，共94頁。第69頁/共93頁第六十九頁，共94頁。二、抑制性消減雜交(zjio)技術 優缺點 優點： 假陽性率大大降低，陽性檢出率為50%以上； 目的序列富集程度較高，且豐度相對一致(yzh)，確保了低豐度表達的cDNA有被檢測的可能極大地提高了檢測效率; 靈敏度高,重復性強. 缺點: 需要較多的起始材料的mRNA,因而某些特殊樣本不容易獲得; 更多地依賴于PCR技術; 不能同時對數個材料進行比較; 材料之間存在的過多差異及小片段缺失也不能有效地被檢測.第70頁/共93頁第七十頁，共94頁。三、代表性差異(chy)分析法 1. 原理 以差減雜交為基礎，從基因組水平篩選和

39、克隆(k ln)基因的方法； 充分利用了PCR反應中雙引物以指數形式擴增雙鏈模板，而單引物僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，并通過降低cDNA群體復雜性和多次更換cDNA兩端接頭等方法,特異地擴增目的基因片段.第71頁/共93頁第七十一頁，共94頁。三、代表性差異(chy)分析法 2. 基本步驟 分別提取試驗組T和驅動組D的RNA并反轉錄成cDNA,然后加上接頭，以接頭特異性引物進行PCR擴增。 擴增產物經限制性內切酶切除去接頭后，給T組酶切產物連上新的接頭，使之區別于D組的cDNA. 用過量的D組酶切產與經修飾過的T組cDNA混合,經變性,退火復性后形成(xngchng)T-D異源雜交分子,

40、T-T同源雜交分子和D-D同源雜交分子. 利用T組新接頭的特異接頭引物時行PCR擴增,T-T同源雜交分將得到有效擴增. 重復2-3次差異雜交步驟,盡可能去除共有序列，對差異表達基因片段進行更有效的富集。 克隆差異表達基因.第72頁/共93頁第七十二頁，共94頁。代表性差異(chy)分析法示意圖第73頁/共93頁第七十三頁，共94頁。三、代表性差異(chy)分析法 優缺點 優點： 免去了物方法分離單，雙鏈的繁瑣操作，通過(tnggu)接頭修飾設計，借助PCR技術即能使目的片段得有效擴增，減少假陽性。 差減雜交在擴增后的cDNA群體之間進行,不再受供試的mRNA量的限制,拓寬了差減雜交的應用范圍.

41、 一次實驗可以分離得到多個在T組和D組間差異表達基因的cDNA克隆,并能發現與表型相關的異常基因,檢測基因的上調和下調表達.第74頁/共93頁第七十四頁，共94頁。三、代表性差異(chy)分析法 優缺點 缺點: 目的基因間豐度的差異在數輪差減雜交后的群體中保留了下來,在后續的篩選中,高豐度的差異基因容易得到,低豐度的差異基因不易檢出，而低豐度的表達產物往往代表相對重要的基因； 分離出來的差異基因也可能與其表型無關，增加了后續鑒定(jindng)的工作量； 對樣品T組和D組的純度要求很高，如果兩組材料間差別較大，則用此方法將達不到鑒定(jindng)差別表達基因的目的。第75頁/共93頁第七十五

42、頁，共94頁。第五節 同源(tn yun)序列法 基于同源序列(xli)的候選基因法 cDNA末端快速擴增技術第76頁/共93頁第七十六頁，共94頁。一、基于同源序列的候選(hu xun)基因法 1. 基本策略 根據已知基因的保守區設計引物，以待分離些基因的植物(zhw)基因組DNA或cDNA為模板直接進行PCR擴增,對擴增產物測序并與已知基因進行序列比較,從而確定該基因是否為待分離基因。 用已知序列的基因制備探針，篩選待分離基因的植物(zhw)核DNA或cDNA文庫.再對陽性克隆進行測序,并與已知基因序時行同源性比較,最后經轉化鑒定是否為待分離的基因。第77頁/共93頁第七十七頁，共94頁。

43、第78頁/共93頁第七十八頁，共94頁。一、基于同源序列的候選(hu xun)基因法2. 需要注意的問題由于密碼子的簡并性和不同的同源序列間同源程度的差異,簡并引物的特異性要設計得當.由于同源序列并不專屬于某一基因( jyn)家族,因而擴增產物不一定是某一基因( jyn)家簇成員.基因( jyn)家族成員往往成簇存，克隆的基因( jyn)片段是否為目的基因( jyn)需進一步轉鑒定。第79頁/共93頁第七十九頁，共94頁。二、cDNA末端(m dun)快速擴增技術1.基本步驟從GenBank等公共數據庫中,比較分析待克隆基因的保守序列區段。以此(y c)保守序列設計特異或簡并引物，從待測植物組

44、織的cDNA中進行PCR擴增,獲得待分離基因的cDNA片段.通過RACE技術獲得cDNA的5和3端,并與已知基因序列進行同源性比較.轉化鑒定是否為待分離的基因。第80頁/共93頁第八十頁，共94頁。二、cDNA末端(m dun)快速擴增技術2. 3RACE利用絕大部分mRNA的3末端具有poly(A),以oligo(dT)和一個接頭組成的接頭引物(adaptor primer,AP)反轉錄mRNA,得到加接頭的第一鏈cDNA根據已獲得的待分離(fnl)基因cDNA片段設計兩條特異引物GSP1(gene specific primer 1,GSP1)和GSP2，分別與已知的接頭引物進行巢式擴增，

45、從而獲得該基因的3端。第81頁/共93頁第八十一頁，共94頁。3RACE技術(jsh)示意圖第82頁/共93頁第八十二頁，共94頁。二、cDNA末端(m dun)快速擴增技術 3. 5RACE 經典方法 用待分離基因的反向特異引物GSP反轉錄總RNA為第一鏈cDNA,在未知的cDNA的5端加上一個接頭. 再用GSP和接頭引物PCR擴增出待分離基因的5端。 環化5RACE 設計目的基因5磷酸化的反向特異引物GSP0，并在其遠端(靠近5端)設計兩條反向特異引物GSP1和GSP2,，在其近端(靠近3端)設計兩條正向特異引物GSP3和GSP4。 用GSP0反轉錄總RNA為第一鏈cDNA,然后通過T4

46、RNA連接酶環化cDNA,并以此環化cDNA為模板用GSP1和GSP4與GSP2和GSP3進行兩輪巢式PCR擴增，從而(cng r)獲得待分離基因的5端。第83頁/共93頁第八十三頁，共94頁。5環化RACE技術(jsh)示意圖第84頁/共93頁第八十四頁，共94頁。二、cDNA末端(m dun)快速擴增技術4. 獲得基因全長的途徑一種方法是對3RACE和5RACE的產物序列的重疊區域分析，經過( jnggu)拼接獲得全長cDNA.另外一種方法是通過分析RACE產物的3和5端序列,重新設計合成相應引物,PCR擴增出全長cDNA.第85頁/共93頁第八十五頁，共94頁。二、cDNA末端快速(kui s)擴增技術 5. 優缺點 優點 操作速度快,節省時間,可在短期內獲得全長的cDNA。 只需極少量的起始反應物質，具有快速，簡便，經濟，實用性強等許多優點。 尤其環化5RACE無須去帽或加錨等煩瑣