1、廣東藥學院碩士研究生學位論文題目：幾類天然產物和嘧啶類化合物與 Lck 激酶相互作用的研究姓 名： 謝文國 學 號： 2111148066 院 系： 中藥學院 專 業： 中藥學碩士 導師姓名： 吳文娟（教授）裘建社（高級制藥工程師）二一四 年 五 月分類號： U D C : 密級: 幾類天然產物和嘧啶類化合物與 Lck 激酶相互作用的研究Studies on the interactions between some natural products and pyrimidines and Lck kinase姓 名： 謝文國 學 號： 2111148066 院 系： 中藥學院 專 業： 中藥

2、學碩士 研究方向：構效關系研究與新藥研發 導師姓名：吳文娟（教授） 裘建社（高級制藥工程師） 論文提交日期： 論文答辯日期：2014 年 5 月 7 日 學位授予單位：廣東藥學院 二一四 年 五 月廣東藥學院學位論文原創性聲明本人鄭重聲明： 本人所呈交的學位論文，系我個人在導師的指導下 進行研究工作所取得的成果。除文中已特別加以標注和致謝的地方外，不 包含其它個人或機構已經發表或撰寫過的研究成果。對本研究做出貢獻的 其它個人和集體，均已在文中明確說明和致謝。本人充分意識到本聲明的 法律結果完全由本人承擔。學位論文作者簽名： 日 期：年月日學位論文使用授權的聲明本人完全了解廣東藥學院有關保留和使

3、用學位論文的規定，學校有權 保留和向有關部門或機構送交本論文的復印件和電子版，允許論文被查閱 和借閱。學校可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫，可以 采用影印、縮印或其它復印手段保存和匯編本學位論文。保密論文在解密后適用本聲明。論文作者簽名：論文導師簽名：日 期：年月日目錄目錄I摘要IVAbstractVI第一章 前 言11.1 引言11.2 Lck 激酶抑制劑研究簡介21.2.1 Lck 激酶的結構與調節機制21.2.2 Lck 介導的信號轉導與疾病發生31.2.3 Lck 抑制劑的發展概況51.2.4 抗炎中草藥的研究概況71.2.5 Lck 抑制劑的 QSAR 研究進展91.3

4、 計算機輔助藥物設計101.3.1 三維定量構效關系（3D-QSAR）101.3.2 分子對接131.4 本文選題意義17參考文獻19第二章 幾類天然產物與 Lck 激酶受體的相互作用研究282.1 引言282.2 材料與研究方法282.2.1 研究的天然產物及其實驗活性值282.2.2 分子動力學模擬302.2.3 分子對接312.3 結果與討論312.3.1 分子動力學模擬312.3.2 分子對接322.4 小結37參考文獻39第三章嘧啶苯并咪唑類似物的 3D-QSAR、分子對接及分子設計研究41I3.1 引言413.2 計算與研究方法423.2.1 化合物與活性數據423.2.2 分子對

5、接473.2.3 分子模型和疊加473.2.4 3D-QSAR 模型的構建483.2.5 偏最小二乘法（PLS）分析和 3D-QSAR 模型的驗證493.3 結果與討論493.3.1 對接的可靠性驗證503.3.2 對接結果503.3.3 CoMFA 和 CoMSIA 分析523.3.4 CoMFA 和 CoMSIA 模型的外部驗證573.3.5 3D-QSAR 等勢圖的解釋593.3.6 具有較高抑制活性的新化合物的設計623.4 小結64參考文獻66第四章 氨基嘧啶類衍生物對 Lck/Src/KDR 激酶三重抑制機理的研究714.1 引言714.2 數據與研究方法724.2.1 研究化合物

6、及其實驗活性值724.2.2 分子對接784.2.3 分子模型和疊加784.2.4 3D-QSAR 模型的構建794.2.5 偏最小二乘法（PLS）分析和 QSAR 模型的驗證794.3 結果與討論804.3.1 對接的可靠性驗證804.3.2 對接結果814.3.3 3D-QSAR 分析834.3.4 Lck 激酶的三維等勢圖分析93II4.3.5 Src 激酶的三維等勢圖分析964.3.6 KDR 激酶的三維等勢圖1004.3.7 Lck，Src 和 KDR 激酶的比較1014.4 小結106參考文獻108第五章 總結與展望1135.1 總結1135.2 展望114碩士期間發表的論文116

7、致謝117III摘要Lck 是一種在 T 細胞和自然殺傷細胞中限制性表達的非受體型蛋白酪氨酸激酶。 它能活化 T 細胞受體信號(TCR)通路并觸發一連串的下游信號通路，導致細胞因子（如 白介素 IL-2，干擾素-）的產生，從而引起相應的免疫反應。在正常情況下，Lck 的 表達和活性是受到限制的。當受到某些外界因素的刺激時，Lck 的表達和活性異常， 從而引起一些自身免疫性疾病、炎癥和過敏性疾病。此外，Lck 激酶在其他細胞中的 異常表達也可以誘發細胞發生病變如結腸癌和小細胞肺癌的發生。因此，選擇性的 Lck 抑制劑能為 T 細胞介導的自身免疫性疾病、慢性器官移植排異反應及相關疾病提 供良好的治

8、療。許多天然產物如大黃素、熏草菌素 、丹寧卡、白皮杉醇及黃酮類等， 以及嘧啶苯并咪唑類似物、苯并噻唑類和氨基嘧啶類衍生物等對 Lck 激酶具有很好的 抑制作用，對這些天然產物及衍生物與 Lck 激酶相互作用的研究有助于尋找新型的 Lck 抑制劑。目前關于這些化合物的提取、合成與藥理的研究已取得了很大的進展， 但這些化合物的結構及其活性的關系以及它們與蛋白受體的相互作用機理尚鮮有報 道，所以，對這些化合物進行定量構效關系(QSAR)、對接分析、作用機理及分子設計 的理論研究是一項非常有意義的工作。本論文選取幾類具有良好 Lck 抑制活性的中藥提取物及其衍生物、嘧啶苯并咪唑 類似物和氨基嘧啶類衍生

9、物為研究對象，運用比較分子力場分析法(CoMFA)、比較分 子相似性指數分析法(CoMSIA)、分子對接和分子動力學模擬等方法對這些化合物進行 了三維定量構效關系(3D-QSAR)和作用機理的研究。探索了幾類中藥提取物與 Lck 激 酶受體相互作用的內在本質，分析它們抑制活性差異的內在原因。同時，通過計算， 建立了具有良好統計質量和可靠預測能力的 3D-QSAR 模型，獲得了抑制劑的結構特 征及其與各靶點蛋白潛在的作用位點和可能的作用模式，并在此基礎上，設計了一些 具有較高活性的新的化合物，為實驗工作者提供理論參考。本文內容包括以下四個部分：第一章前言，簡要介紹 Lck 激酶的作用機理以及國內

10、外研究現狀，對已報道的幾 類 Lck 激酶抑制劑可能的作用機理及其理論方面的研究進展進行了系統的總結。簡要 介紹了目前國內外對抗炎中草藥及天然產物的研究概況。簡要介紹了計算機輔助藥物 設計的進展、基本原理和常用方法，并說明了本課題對于新型 Lck 抑制劑定量構效關IV系(QSAR)及作用機理理論研究的意義。 第二章，采用分子動力學模擬和分子對接的方法，對幾類中藥提取物及衍生物與Lck 激酶的相互作用進行了研究。分析了這些中藥提取物及衍生物與 Lck 激酶可能的 結合模式和相互作用本質。探討了不同天然產物 Lck 抑制活性差異的內在分子機制， 為這些天然產物的優化和結構修飾提供了一定的理論指導。

11、第三章，選取一系列嘧啶苯并咪唑類似物，對其進行了 3D-QSAR 以及分子對接 研究，建立了具有良好統計質量和可靠預測能力的 3D-QSAR 模型，并獲得最佳的對 接構象。研究發現抑制劑在活性位點周圍受體環境的特征與三維等勢圖相一致，進一 步表明所建立的 3D-QSAR 模型的可靠性。根據 3D-QSAR 和分子對接分析的結果， 設計了一些具有較高活性的新的化合物。第四章，選取一系列對 Lck/Src/KDR 具有多重抑制作用的氨基嘧啶衍生物，采用 3D-QSAR 和分子對接分別從統計學角度和微觀角度上研究該類化合物可能的構效關 系及其與 Lck/Src/KDR 蛋白的相互作用。首先，采用 3

12、D-QSAR 的方法建立合理可靠 的理論模型，并對可能影響化合物活性的主要因素進行了詳細的討論。同時，通過分 子對接方法獲得了該類抑制劑分別與 Lck、Src 和 KDR 三個激酶的相互作用關系。此 外，通過對比三個蛋白活性位點的異同，探索了該類抑制劑具有多重抑制功能（對 Lck、Src 和 KDR 激酶）的內在原因。本章研究為進一步合成新型具有 Lck/Src/KDR 多重抑制功能的化合物提供了理論參考。最后，對本論文的研究工作作了簡要的總結與展望。關鍵詞：Lck 激酶；天然產物抑制劑；定量構效關系；分子對接；作用機理VStudies on the interactions between

13、some natural products and pyrimidines and Lck kinase Master candidate: Wenguo Xie(Master of Tranditional Chinese Medicine) Supervisor: Prof. Wen-juan WuAbstractLymphocyte-specific kinase (Lck) is a non-receptor protein tyrosine kinase in the Src-family with restricted expression in T-cells and natur

14、al killer (NK) cells. Many reports have shown that the activation of TCR signaling by Lck may arouse a cascade of downstream signaling pathways and lead to the production and release of cytokines including interleukin-2 (IL-2) and interferon-, which causing the corresponding immune responses. Normal

15、ly, the expression and activity of Lck is limited. However, when stimulated by some outside factors, its abnormal expression and activity would cause some T-cell mediated autoimmune diseases, inflammation and allergic diseases. In addition, the ectopic expression of Lck kinase in other cells can ind

16、uce cell pathological changes, such as colon cancer and small cell lung cancer. Therefore, the Lck selective inhibitors would be expected to provide a promising approach for treating T-cell mediated autoimmune and inflammatory diseases and chronic organ transplantation rejection. Many natural produc

17、ts and compounds possess good inhibition to Lck kinase, such as Emodin, Lavendustin A, Damnacanthal, Piceatannol, flavoid, benzimidazole-pyrimidines, benzothiazoles and aminopyrimidine derivatives. Hence, the research and development of these natural products and compounds could be used to find the

18、new Lck inhibitors. Although some progress has been made in experimental researches, so far the theoretical studies on action mechanisms between these compounds and their receptors and the correlations between structures of these compounds and their inhibitory activities are still unfrequent. So it

19、is aVIvery interesting and significant work to carry out the studies on quantitative structure-activity relationship (QSAR), docking, action mechanism and molecular design for these compounds.In this dissertation, theoretical studies on three dimensional quantitative structure activity relationship

20、(3D-QSAR) and action mechanism of some natural products and series of compounds with anti-inflammatory activity, have been carried out using comparative molecular field analysis (CoMFA), comparative molecular similarity analysis (CoMSIA) docking analysis and molecular simulation. The interaction mec

21、hanism between these series of natural products and Lck kinase were studied, to analyze the differences of their Lck inhibitory activities. Meanwhile, QSAR models showing a significant statistical quality and satisfying predictive ability were established, and appropriate binding sites and models of

22、 these compounds interacting with their receptors were also revealed. Based on these results, some new compounds with higher activity have been designed. We hope these theoretical results can be confirmed by experimental work.Four chapters are included in this dissertation.The first chapter is intro

23、duction. The progress in the study of Lck kinase inhibitors, is briefly reviewed. The research status on some reported Lck kinase inhibitors and the action mechanism are also systematically summarized. The general research situations of Chinese medicine and natural products at home and abroad are br

24、iefly introduced. And the progression, basic principles and methods of computer-aided drug design are briefly introduced. Thus the significance of the theoretical studies on the quantitative structure-activity relationship (QSAR) and action mechanism of novel Lck inhibitors is elucidated.In the seco

25、nd chapter, some series of extracts of traditional medicines were selected to study their interaction with Lck kinase using molecular dynamics and docking studies methods. The possible binding mode and action mechanism between these natural products and Lck kinase were analyzed. The differences of t

26、heir Lck inhibitory activities were illustrated. These researches could provide some theoretical guidances for the optimization and structure modification of these natural products.VIIIn the third chapter, a series of benzimidazole-pyrimidines analogues as Lck inhibitors were selected to perform 3D-

27、QSAR and molecular docking studies. The 3D-QSAR models with significant statistical quality and good predictive ability were established and the best docking conformations of these compounds were obtained. The contour maps of 3D-QSAR were in good accordance with the receptor environment in the bindi

28、ng site. Based on the results of 3D-QSAR and docking studies, some new compounds with more potent inhibitory activity were theoretically designed.In the fourth chapter, a series of aminopyrimidine derivatives with three-targeted Lck/Src/KDR inhibitory activities were selected to study the possible s

29、tructure-activity relationship and interaction between inhibitors and Lck/Src/KDR proteins in terms of statistical and microscopic viewpoint by using a combined 3D-QSAR and docking analysis. Firstly, 3D-QSAR models showing significant statistical quality and satisfying predictive power were establis

30、hed and main factors influencing the anti-inflammatory activities of inhibitors were discussed in detailed. Meanwhile, the relationships between aminopyrimidine derivatives and Lck/Src/KDR kinases were obtained through molecular docking. In addition, the internal reasons for the inhibitors with thre

31、e-targeted Lck/Src/KDR inhibitory activities were explored by comparing the differences and similarities of Lck/Src/KDR kinases. These results can provide a helpful theoretical reference for further synthesizing novel compounds with three-targeted Lck/Src/KDR inhibitory activities.Finally, the concl

32、usions, deficiencies and prospect were briefly summarized for this work.Keywords: Lck kinase, natural product inhibitors, QSAR, molecular docking, action mechanismVIII第一章 前 言1.1 引言人類的許多疑難疾病如紅斑狼瘡、風濕性關節炎、糖尿病等是危害人們健康的常 見疾病，尋找高效低毒的免疫抑制劑一直是人類不懈奮斗的目標。目前臨床常用的免疫抑制劑主要有類固醇類藥物、抗代謝藥、鈣神經蛋白抑制劑 以及抗淋巴細胞的單抗藥。但這些免疫抑制

33、劑由于存在難以避免的毒副作用，如繼發 感染、誘發腫瘤、腎毒性、肝毒性等1-4，且選擇性低等缺點。因此，尋找新靶點，開 發高效、低毒、高選擇性的新型免疫抑制劑成為藥學工作者的研究目標。自身免疫性疾病(autoimmune disease, AID)是機體免疫系統對自身組織細胞發生 免疫應答而造成的細胞破壞或組織損傷而出現的臨床癥狀，當免疫系統調控出現紊亂 時則會導致自身免疫等疾病的發生。許多報道發現，T 細胞在適應性免疫應答中起著 關鍵的作用，T 細胞主要介導細胞免疫反應，特異 T 細胞的免疫特異性由 T-細胞抗原 受體（TCR）或 CD3 復合物確定。研究表明，Src 蛋白酪氨酸激酶家族中的

34、Lck 和 Fyn 在 TCR 的信號轉導中有重要作用。而由 TCR 介導的信號通路已成為開發新型免疫抑 制劑的研究熱點。淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, Lck or p56Lck )是一種在 T 淋巴細胞和自然殺傷細胞中特異性表達的 Src 家族的細胞質酪氨 酸激酶5。對于正常 T 細胞的發育和分化的信號介導而言，Lck 激酶活性是至關重要 的。一般情況下，Lck 激酶的表達及其活性是受限的，然而當受到某些因素刺激時， Lck 激酶的異常表達及激活會引起 T 細胞的異常增值分化，從而引起 T 細胞介導的自

35、 身免疫性疾病、炎癥性疾病和器官移植排斥反應的發生。因此，抑制 Lck 激酶的過度 活化從而緩解、治療疾病已成為當前臨床治療學研究的熱點, 對 Lck 活化信號調節通 路的研究將為有效治療以上疾病并發展新的治療方法提供一個新的策略6。隨著對Lck激酶小分子抑制劑合成研究的不斷深入，其抗炎及免疫抑制作用機理 的研究也隨之展開。目前，研究人員普遍認為酪氨酸激酶抑制劑與受體相互結合后， 可催化ATP的磷酸基與受體的酪氨酸相結合，使受體發生自磷酸化，不僅可激活受體 內在的催化活性，而且可生成下游效應蛋白的結合位點7。然而，對Lck抑制劑的結構1與活性的關系以及它們與受體蛋白相互作用規律的理論研究卻鮮有

36、報道，因此，通過 計算機輔助藥物設計的方法對Lck激酶抑制劑進行定量構效關系（QSAR）及分子對接 研究，可獲得抑制劑結構對活性的調控規律，分析它們與激酶蛋白的結合模式，從而 深入理解Lck激酶抑制劑的抗炎及免疫抑制作用機理，可為設計合成新型高效的抗炎 及免疫抑制藥物提供理論參考。1.2 Lck 激酶抑制劑研究簡介1.2.1 Lck 激酶的結構與調節機制在各種分子靶點中，蛋白酪氨酸激酶(PTK)是目前研究較多且效果明顯的分子生 物靶點8,9。蛋白酪氨酸激酶作為一種催化酪氨酸殘基磷酸化的激酶，是調節細胞生長 分化信號傳遞的重要組成部分，通常可分成兩個系列：受體型酪氨酸激酶和非受體型 酪氨酸激酶。

37、Src是一種非受體型酪氨酸激酶（non-receptor tyrosine kinases, RTKs）， 通過細胞外配體與受體結合及細胞周期特殊階段的細胞粘附分子激活，在蛋白質之間 的介導信號傳導方面起著關鍵作用10。迄今為止，Src激酶家族有Src、Abl、Fyn、Yes、 Blk、Yrk、Lck、Lyn和Csk九個成員，它們結構相似，具有相同的功能域，共同參與 細胞的轉化及細胞內信號傳導過程，具有重要的生理功能11,12。其中，Fyn，Src和Yes 存在于絕大多數細胞中，而Lck，Hck和Blk只出現在某些特定的組織中，在細胞的信 號轉導過程中發揮著特殊的作用。Lck是一種在T淋巴細胞

38、和自然殺傷細胞中特異性表達的蛋白酪氨酸激酶。Lck激 酶由509個氨基酸殘基組成，分子量為56k。它是由下面幾個區域構成，首先在N-末端 具有一段特定的短序列激酶區，與細胞膜的激酶定位有關13；二是SH3結構域，是由 一段約70個氨基酸組成的特異性結合到富含脯氨酸和其它疏水性氨基酸肽鏈的長靶 序列；三是SH2結構域，是由約100個氨基酸組成的與特定的多肽序列結合的區域；四 是可變區，是由C-末端負調控尾巴組成的激酶結構域。這里的每一個結構片段對激酶 活性的調控都起著關鍵的作用14。而針對與激酶結構域的作用則是Lck抑制劑設計的 重點，它是由N和C末端殘基及位于兩殘基接口處的ATP結合位點組成，

39、連接兩個殘基 的是ATP和抑制劑結合的鉸鏈區或連接域。X射線晶體學研究表明，許多早期設計的 Lck抑制劑(如PP2)與連接區域的Met319和Glu317形成氫鍵作用，填補了腺苷結合位點2并把取代物投放到附近的疏水口袋內15。這類抑制劑與激酶的活性構象相結合并由活 化的loop殘基來穩定，此類抑制劑稱為I型(或DFG-in)抑制劑。而與靶向激酶非活性構 象結合的抑制劑則是采用擴展的構象來填補腺苷結合位點和Lck疏水口袋的，另外擴 展的疏水口袋是由保守DFG序列的苯丙氨酸側鏈的撤離而形成的，故此類抑制劑又稱 為型(或DFG-out)抑制劑16。此外還有一些激酶的特殊構象，如靶向gate-keep

40、er附近 的Thr316殘基。可以考慮設計與Thr316殘基形成氫鍵的抑制劑，從而增加其選擇性17。圖1-1 Lck激酶結構示意圖 Figure 1-1 Structure of Lck kinaseLck含有兩個可供調節的酪氨酸殘基（tyr394和tyr505），tyr394的磷酸化可正調控激酶活性，而tyr505的磷酸化則負調控激酶活性。在T細胞活化信號傳導過程中，Lck 是最早被激活的上游信號分子之一。近年來的大量研究表明，Lck通過與CD4、CD8 鏈及IL-2R鏈結合，通過參與T細胞分化、活化的信號傳導，對T細胞的正常發育及其 經T細胞受體（TCR）識別抗原后的活化起重要的作用18,

41、19。缺少Lck的T細胞無法對T 細胞受體（TCR）的刺激做出反應。因此，抑制Lck活性能有效阻滯T細胞引起的免疫 反應，針對Lck激酶的抑制劑能有效地阻斷T細胞的功能。作為免疫抑制劑，可用于治 療自身免疫性疾病，諸如風濕性關節炎、紅斑狼瘡、異體器官移植而造成的過敏反應， 利用其抑制細胞增殖的原理，可用于控制腫瘤細胞的生長繁殖，從而達到對多種癌癥 的治療作用20,21。1.2.2 Lck 介導的信號轉導與疾病發生Lck激酶在T細胞活化的信號通路中發揮著重要作用（見圖1-2）。T細胞活化之前， Lck首先通過N-末端的胱氨酸與CD4和CD8復合受體形成非共價鍵。T細胞和抗原呈遞 細胞的相互作用會

42、導致 Lck 激 酶 的 活 化 和 ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) 的磷酸化。這些磷酸化作用可導致與酪氨酸激酶 ZAP-70 (zeta-associated protein 70)的SH2結構域的結合位點的產生從而使ZAP-70激酶得到激 活。隨后，Lck和ZAP-70可進一步刺激多個信號網絡，包括鈣動員，Ras/MAPK，PI3K3和Rho/Racl822。此外，在胸腺細胞中，Lck激酶也能夠磷酸化ZAP-70激酶，促進相關 下游信號轉導分子的募集，進而影響細胞的增殖和分化23。在初級T淋巴細胞中，Lck 激

43、酶還控制細胞活化的閾值，并且可以在細胞活化后激活ERK激酶23,24。另外，Lck 激酶還參與了白介素-2（IL-2）的信號轉導途徑，調控T細胞的增殖。遺傳學研究表明， 在Lck激酶缺失或Lck激酶表達結構域失活的小鼠中，T細胞的成熟過程明顯受到了抑 制25,26。因此，對正常T細胞的發育和活化的介導信號而言，Lck激酶的活性是至關重 要的。Lck選擇性抑制劑可用于治療T細胞介導的自身免疫性疾病和炎癥性疾病，如風 濕性關節炎、紅斑狼瘡、炎癥性腸病、I型糖尿病、潰瘍性結腸炎、血管炎、重癥肌無 力等疾病。同時，可為器官移植排斥反應提供治療27,28。圖1-2 T細胞受體信號轉導通路 Figure1

44、-2 T cell receptor signalling.此外，Lck激酶在T淋巴細胞中的特異性分布及其對細胞周期的調控意味著Lck激酶在其他細胞中的異位表達可以誘發細胞發生病變29。在急性髓樣白血病(Acute myeloid leukemia，AML)中，Lck激酶的表達量明顯升高，而一旦其表達量降低，病癥 也得到緩解。這說明Lck激酶的異常可能是導致了疾病的發生的原因30。同時，還有 研究表明Lck激酶的異位表達也能引發結腸癌和小細胞肺癌31。41.2.3 Lck抑制劑的發展概況由于Lck激酶在正常T細胞發育和活化的信號轉導通路中發揮著至關重要的作用， 因此，Lck激酶抑制劑作為新型的

45、治療T細胞介導的自身免疫性疾病、炎癥性疾病和器 官移植排斥反應的藥物已成為當前新藥開發的一個熱點研究領域。上世紀80年代人們 就開始了Lck抑制劑的開發，最初從天然植物中提取化合物，后來通過化學合成物質 進行高通量篩選尋找合適的化合物。之后隨著量子化學與計算化學等理論化學的發 展，研究者們開始了理論模型的構建，利用構效關系設計并合成可能具有良好活性的 分子并進行檢測，開發出多種Lck抑制劑。其中，最早開發的是從植物中提取的天然產物 Lavendustin A32，Piceatannol33， 丹寧卡 Damnacanthal34和它們的衍生物35，它們可作為非選擇性的酪氨酸激酶抑制 劑；還有來

46、源于中藥材的大黃素 Emodin36、4-Amino-6-hydroxyflavone37、魚腥草中 的黃酮類、苷類（白芍苷 TGP、雷公藤多苷 GTW、絞股藍總苷、黃芩總苷、三七總 皂苷等）及生物堿（青藤堿、芬防己堿等）等；微生物的化合物中，Kyowa Hakko 小 組分離得到的鏈霉菌產物 Lymphostin38具有抑制 Lck 激酶的活性；Cushman 等人合成 的黃酮類化合物39，從 Tyrphostins 派生得到的衍生物40，Myers 報道的一系列喹唑啉 類化合物41都具有抑制 Lck 的活性。同時 Lck 還是一個高度同源 Src 家族激酶，脫靶 抑制其它 Src 家族成員

47、有可能導致多種細胞功能的抑制，包括細胞生長、分化與存活 等，因此，可開發作為多靶點抑制劑。多靶點激酶抑制劑因可同時作用于某一疾病相 關病原體的多個分子靶點，能抑制不同的細胞通路，具有廣泛的生物活性和選擇性， 且能克服單靶點藥物長期使用引起的耐藥性，可以達到更好的治療效果，已成為當前 藥物研發的熱點和前沿領域。Hanke 發現的吡唑啉嘧啶類化合物 PP1對活化酶的 Src 酶系具有選擇性作用42，及與之相關的由 BASF 小組近期報道的化合物43,44，Kraker 等人報道的吡啶酮2, 3-d嘧啶類化合物45，以及其它一些化合物等46-55，它們同時具 有抑制 Lck/Src 激酶的抑制作用。

48、圖1-2和圖1-3給出其中有代表性的化合物結構及其活 性。5H NOOOMeCHONNHOHMeOOOMeStaurosporine Lck IC50=0.003MDamnacanthal Lck IC50=0.017MMeOHOOClONNOMeHOAcHNOHRadiciolLck IC50=0.027MNH2Lymphostin Lck IC50=0.05MOHOOHOHOOHOHOHOOOHHOMeHOMeGenistein Lck IC50=4.5MCO2HOHHypericin Lck IC50=7MOHOHNHOOHOHHOHOLavendustin A Lck IC50=8MP

49、iceatannol Lck IC50=66M圖1-2 天然提取的部分Lck抑制劑Figure 1-2 Part of the Lck inhibitors of natural extract.6圖1-3 化學合成的部分Lck抑制劑Figure 1-3 Part of the Lck inhibitors of chemical synthesis.1.2.4 抗炎中草藥的研究概況1.2.4.1 研究現狀中草藥中分離得到的許多活性天然產物具有比較豐富的生理功能，對其進行大力 的開發應用具有廣闊的發展空間。中草藥是我國醫藥界的一塊瑰寶，開展以中草藥為7基礎的活性天然產物研究已成為國內外天然藥物

50、開發利用的研究熱點。 近幾年來，中草藥的抗炎作用已經受到廣泛關注。臨床及實驗證實很多中草藥具有很好的抗炎作用，研制出如雷公藤、昆明山海棠等許多抗炎藥及其復方。對于炎性 反應目前認為中草藥具有多種抗炎機制，因此，如果能構建一套中草藥提取抗炎化合 物或篩選優化抗炎天然產物的評估方法，在開發中草藥的抗炎功效方面是一項非常重 要的發展策略。1.2.4.2 常見的具有抗炎功效的中草藥及其抗炎的有效成分抗炎藥物是指對炎性反應有抑制作用或調節作用的一類藥物，主要適用于炎癥免 疫性疾病。近十多年來，我國抗炎中草藥的研究有了很大的發展，中草藥可抗炎被人 們所深信，我們熟知的具有抗炎功效的中藥有粉防己、雷公藤、柴

51、胡、黃芩、三七、 草木樨屬植物等。具有抗炎作用的中草藥涉及多種植物種屬，其活性成分涉及到生物堿、苷、多糖 等。生物堿是一類常見的具有抗炎作用的生物活性成分，常見的具有抗炎作用的生物 堿有粉防己堿、苦參堿、小檗堿、雷公藤新堿等；常見的具有抗炎作用的苷類很多， 包括皂苷、黃酮苷、香豆素苷等多種類型，如雷公藤多苷、柴胡總苷、三七總皂苷、 人參皂苷等；具有抗炎作用的多糖有黃芪多糖、靈芝多糖、人參多糖、枸杞多糖等56。 1.2.4.3 中草藥的抗炎作用機制目前大量的研究表明，中草藥具有多種抗炎作用機制，有些是對炎性介質的產生 和分泌產生影響，有些是對下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能產生影響57。炎性介質又稱

52、 “化學介質”，是參與炎性反應的化學活性物質。炎性介質包括細胞因子和趨化因子， 它們與炎性細胞的相互作用構成炎性反應的主要成分58。其中腫瘤壞死因子（TNF）、 白細胞介素 1（IL-1）、氧自由基等在炎性反應發生時發揮主要作用，稱為促炎反應介 質，而 IL-4、IL-5 等在炎癥消退時起主要作用，稱為抗炎反應介質59。經研究，柴胡 皂苷可促進分泌、提高血清中皮質酮水平，有促進丘腦-垂體-腎上腺系統功能的作用。 柴胡皂苷對炎癥的滲出作用較弱，而對肉芽腫具有較強的抑制作用60。1.2.4.4 抗炎中草藥的臨床應用目前，抗炎藥在臨床上應用十分廣泛，僅次于抗感染藥。除了非甾體類抗炎藥和 腎上腺皮質激

53、素類外，中草藥也是應用很廣泛的抗炎藥。因此近年來，中草藥的抗炎 藥理研究成為當今世界上新藥開發的熱點，也是中醫藥現代研究十分活躍的領域。8我國的傳統中藥經多年的臨床及實驗證實，很多中藥均具有良好的抗炎作用，且 毒副作用小、資源豐富。中藥抗炎一號的研制及臨床研究表明其在治療自身過敏性皮 炎、接觸性皮炎等方面具有較好的療效61。臨床觀察發現止痛熱敷靈具有較高的抗炎 鎮痛作用，對肩周炎、關節炎等具有很好的療效，既實現了中醫傳統療法的優點，又 采用了現代制劑方法，取得了明顯的治療效果62。另有臨床研究表明，苦參注射劑除 了可以治療腫瘤外，對慢性乙型肝炎的治療效果也很理想，臨床上還有用苦參治療中 耳炎、

54、白賽氏綜合征等疾病63。目前，國內外的眾多研究機構也開展了很多中草藥抗炎的探索，但某些臨床療效 遠未達到理想水平，一方面在于炎癥系統的復雜性，現行的方法難以確切地評價其療 效；另一方面，也反映了中草藥的抗炎藥理研究中還存在著一些問題。 雖然一些新的分子和基因水平的相關研究不斷涌現，但是，也應看到絕大部分中草藥 抗炎作用的分子機制研究，其具體的作用過程還了解得不夠詳細和全面，而且在基因 水平的研究仍然相當少。中草藥資源豐富，單味中藥、中藥復方制劑、中草藥有效部 位和有效成分等均有抗炎作用的報道，以中藥為基源的抗炎成分、機理研究與創新藥 物的開發具有廣泛前景。1.2.5 Lck抑制劑的QSAR研究

55、進展在過去的幾十年里，Lck激酶抑制劑作為治療炎癥性疾病、自身免疫性疾病、器 官移植排斥反應和癌癥及艾滋病等疾病的藥物而受到廣大新藥研發者的關注。其中包 括大量的的理論研究者，他們利用量子化學計算方法、比較分子場分析（CoMFA）方 法、比較分子相似性指數分析（CoMSIA）方法和分子對接等理論方法對Lck小分子抑 制劑進行了相關的定量構效關系（QSAR）研究，為新型Lck抑制劑的設計開發提供了 大量的理論指導。Hoffmann-La Roche64報道了二氫嘧啶4, 5-d嘧啶酮類Lck抑制劑并 對其進行了分子對接研究，揭示了二氫嘧啶4, 5-d嘧啶酮類抑制劑與Lck激酶受體相 互作用的重要

56、規律，得到可靠且預測能力強的模型，為設計新型高效的Lck激酶抑制 劑提供了理論指導。Mahendra Awale65對N-4-嘧啶-1H-吲唑-4-胺類Lck抑制劑進行了 分子對接和3D-QSAR的CoMFA研究，發現該類化合物中嘧啶環上的氮原子及氨基分 別能與Lck激酶的氨基酸殘基Met319上的氨基骨架和羰基骨架形成氫鍵并在配體-受 體的相互作用中發揮重要作用。Matthew W. Martin66,67合成了一系列2-氨基嘧啶氨甲 酸酯類Lck抑制劑，并對其進行了一系列的構效關系研究，探討了化合物活性與結構9的關系，闡明該類抑制劑與Lck激酶的相互作用特征。1.3 計算機輔助藥物設計計算機輔助藥物設計（computer-aided d