1、PCR技術簡介,主要內容,PCR RT-PCR（reverse transcriptional-PCR） 瓊脂糖凝膠電泳,PCR的概念,PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶鏈反應技術，它是以待擴增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引物的介導下，利用耐熱DNA聚合酶的酶促作用，通過變性-復性-延伸的循環操作，快速特異地擴增出特定的DNA片斷,DNA的復制 核酸體外擴增的設想 1985年Mullis等人發明了聚合酶鏈反應（PCR） 耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后誕生了第一臺PCR自動化熱循環儀 1989年美國Science雜志列PC

2、R為十余項重大科學發明之首,比喻1989年為PCR爆炸年 1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎,PCR技術簡史,PCR的原理,PCR反應時，一般采用變性-復性-延伸三步循環。 1變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈,2復性（退火）：通過降低反應溫度至45-700C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3端粘合,PCR的原理,PCR的主要用途,目的基因的克隆 基因的體外突變 生成大量DNA以進行序列測定 特異基因表達量分析,PCR反應體系,20ul；25ul；50ul,PCR實驗準備試劑,Taq酶 0.5-2.5 U

3、/50 l（通常2.5 U/50 l ） 酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量 從生物公司購買：生工；華美；Takara;Promega; 與buffer,mg2+成套出售,Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑 1.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系（通常4 l/50 l ） Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降； Mg2+過高影響反應特異性,PCR實驗準備試劑,PCR實驗準備試劑,Buffer 提供合適的PH值 有10buffer和2buffer 有的buffer中含有mg2+，有的buffer中不含有mg2,PCR實驗準備試劑,dNTP dATP，dT

4、TP， dGTP ，dCTP 可以購買dNTP混合液，也可以購買dATP，dTTP， dGTP ，dCTP等體積混合 四種dNTP濃度應相等 每種200umol/L（通常4 l/50 l ） 濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量,PCR實驗準備試劑,模板（DNA或cDNA） 單、雙鏈DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類 一般50ng DNA模板/50L 模板濃度過高會導致反應的非特異性增加 提取細胞或組織中的基因組DNA,PCR實驗準備試劑,ddH2O 滅菌的去離子水或雙蒸水,PCR實驗準備試劑,引物 0.1-0.5 mol/L（通常10pm

5、ol的引物2ul/50ul） 濃度過高易導致模板與引物錯配，反應特異性下降 利用軟件（Omiga、Primer primier）設計引物后，由生物公司（生工、賽百盛）合成，收到合成完畢的引物后根據說明對引物進行稀釋，一般稀釋成10pmol使用 引物設計中需關注的有上下游引物之間的長度，即將來PCR產物的大??；以及上下游引物的Tm值，即將來PCR中的退火溫度,PCR實驗準備-試劑,引物設計原則： 1.長度以1530個堿基為宜 2.正向反向兩條引物鏈之間的距離適中，一般使擴增出的片斷在300-1100bp之間。如果使用RT-PCR檢測RNA病毒，引物間距離以500bp最佳。片斷過短影響結果判定，過

6、長則不易擴增 3.引物堿基組成應隨機分布，G+C含量在45-55為宜。過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大 4.引物自身不形成二級結構，引物間沒有互補序列（4個堿基以上），引物間3端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗 5.引物序列具有特異性 6.引物3端堿基與模板DNA一定要配對，并且3末端堿基最好選T、 C或者G，不選A。因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高,PCR實驗準備-儀器、耗材,PCR儀 移液器 吸頭 200ul PCR管 EP管架 槍頭盒 PCR板 冰盒,重復13步 2530輪,目的DNA片段 擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈

7、與引物復性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,PCR反應程序,PCR反應程序,變性溫度:94C or 95C ,不變； 延伸溫度：72C，不變； 退火溫度：50C左右，可變，Tm值-5,延伸時間：30-60s，與PCR產物的大小有關，參考酶的延伸效率（通常1000bp/min,PCR反應程序,1) 94變性3min， (2) 94變性30sec， (3) 52 退火30sec， (4) 72 延伸1min。 (5) goto(2)repeat29, （6）72 延伸10min。 （7）hold at 4,PCR操作過程,混勻，瞬時離心3-5sec,PCR操作過程,PCR操作過程,

8、RT-PCR（reverse transcriptional-PCR,RT-PCR原理,RT-PCR主要用途,檢測特異基因的表達量 特異基因的組織定位 構建cDNA文庫 鑒定已轉錄序列是否發生突變,RT-PCR反應體系,一步法RT-PCR,RT-PCR反應體系,兩步法RT-PCR,cDNA PCR擴增,cDNA第一鏈合成反應,RT-PCR的準備-試劑,提取細胞或組織中RNA 購買RT-PCR試劑盒（一步法或兩步法,RT-PCR的準備-耗材、儀器,超凈臺 PCR儀 移液器 吸頭 200ul PCR管 EP管架 槍頭盒 PCR板 冰盒,RT-PCR過程中cDNA第一鏈合成反應所用的槍頭、槍頭盒、P

9、CR管等塑料制品均提前用氯仿進行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180干烤6-8小時。加樣過程在超凈臺內進行，需戴手套與口罩。 cDNA PCR擴增的準備工作同普通PCR反應,RT-PCR反應程序,1) 4230min， (2) 943min， (3) 94變性3min， (4) 94變性30sec， (5) 52 退火30sec， (6) 72 延伸1min。 (7) goto(4)repeat29, （8）72 延伸10min。 （9）hold at 4,RT-PCR操作過程,cDNA第一鏈合成反應所用槍頭、槍頭盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿進行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180干

10、烤6-8小時。在超凈臺內按試劑盒說明書進行加樣，加樣過程需戴手套與口罩。 cDNA PCR擴增的準備工作同普通PCR反應。 在PCR儀上設定程序進行反應,瓊脂糖凝膠電泳的原理,瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定核酸片段的有效方法，瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質的特性，利用電荷效應，在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下，帶負電的核酸分子向正極遷移。利用分子篩效應可以分離不同片斷大小和不同構象的DNA、RNA分子,瓊脂糖凝膠電泳的主要用途,分離不同片斷大小和不同構象的DNA、RNA分子。 鑒定DNA片段，如PCR產物的鑒定。 純化DNA分子,瓊脂糖凝膠電泳的準備-試劑,瓊脂糖 電泳緩沖液：T

11、ris，冰乙酸，EDTA（TAE） 6X載樣緩沖液（Load buffer）：溴酚藍，蔗糖 染色液：goldview DNA或RNA樣品 DNA分子量marker,瓊脂糖凝膠電泳的準備-儀器、耗材,電泳儀 電泳槽 微波爐 三角瓶 移液器 電子天平 槍頭 凝膠成像系統,瓊脂糖凝膠電泳的操作過程,1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60，加入5l的goldview，并搖勻。） 裝好制膠板，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固。 充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm,瓊脂糖凝膠電泳的操作過程,用移液器吸取PCR產物10