博士專題 基因功能研究技術(shù)之 基因敲除 基因編輯技術(shù) 劉惠榮內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 1 II 基因敲除 可以使基因的功能完全缺失 基因敲除 又稱基因打靶 是一種遺傳工程技術(shù) 是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組 能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上 從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的 傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機(jī)交換 但在體細(xì)胞內(nèi) 基因同源重組的效率特別低 低于10 6 增加了實(shí)際操作的工作量 限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用 1987年 Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型 此后基因敲除技術(shù)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善 目前該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接 最有效的方法之一 2 基因敲除技術(shù)分為完全基因敲除 條件型基因敲除 誘導(dǎo)型基因敲除 完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性 條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除 誘導(dǎo)型基因敲除是通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制 在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行敲除的技術(shù) 3 基因載體的構(gòu)建 把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因 如neo基因 TK基因等 的載體上 成為重組載體 基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能 所以一般設(shè)計(jì)為替換型載體 一 完全基因敲除 4 基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制 有些重要的靶基因被敲除后會(huì)引起胚胎早期死亡 使得無(wú)法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能 某些基因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能 完全敲除會(huì)導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型 使研究者很難判斷異常的表型是由一種細(xì)胞引起的 還是由幾種細(xì)胞共同引起的 5 二 條件型基因敲除 條件型基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的敲除限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法 該系統(tǒng)在80年代被引入后 已成功被應(yīng)用于酵母菌 植物 哺乳動(dòng)物細(xì)胞及小鼠身上 現(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的Cre Loxp系統(tǒng)和釀酒酵母的FLP FRT系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛 6 Cre LoxP重組酶系統(tǒng) Cre LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用 是條件型基因打靶 誘導(dǎo)型基因打靶 時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心 7 Cre LoxP重組酶系統(tǒng) Cre重組酶 于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn) 屬于 Int酶超基因家族 Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453 編碼38kDa蛋白質(zhì) Cre重組酶是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白 它不僅具有催化活性 而且與限制酶相似 能識(shí)別特異的DNA序列 即loxP位點(diǎn) 使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組 Cre重組酶有70 的重組效率 不借助任何輔助因子 可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物 如線形 環(huán)狀甚至超螺旋DNA 8 Cre LoxP重組酶系統(tǒng) LoxP locusofX overP1 序列 來源于P1噬菌體 是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成 8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向 Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價(jià)結(jié)合 13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域 其序列如下 5 ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT 3 3 TATTGAAGCATAT TACATACG ATATGCTTCAATA 5 9 Cre LoxP系統(tǒng)的特性 10 條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法 它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上 利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù) 在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的 按鈕 從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài) 11 12 13 Cre loxP系統(tǒng)作用原理示意圖 14 FLP FRT系統(tǒng) 該系統(tǒng)與Cre loxP系統(tǒng)相同 也是由一個(gè)重組酶和一段特殊的DNA序列組成 從進(jìn)化的角度上考慮 Flp FRT系統(tǒng)是Cre loxP系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)的同源系統(tǒng) 其中 重組酶Flp是酵母細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)由423個(gè)氨基酸組成的單體蛋白 與Cre相似 Flp發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子 同時(shí)在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性 該系統(tǒng)的另一個(gè)成分Flp識(shí)別位點(diǎn) Flprecognitiontarget FRT 與loxP位點(diǎn)非常相似 同樣由兩個(gè)長(zhǎng)度為13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)長(zhǎng)度為8bp的核心序列構(gòu)成 在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí) FRT位點(diǎn)的方向決定了目的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn) 這兩個(gè)系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是它們發(fā)揮作用的最佳溫度不同 Cre重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為37 而Flp重組酶為30 因此 Cre loxP系統(tǒng)最適宜在動(dòng)物體內(nèi)使用 loxP和FRT位點(diǎn)的序列如圖所示 15 這一技術(shù)亦存在一些缺點(diǎn) 費(fèi)用太高周期較長(zhǎng)許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變 可能是這些基因的功能為其他基因代償所致 條件型基因打靶的優(yōu)勢(shì) 克服了重要基因被敲除所導(dǎo)致的早期致死并能客觀 系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生 發(fā)育以及疾病發(fā)生 治療過程中的作用和機(jī)制 16 三 誘導(dǎo)型基因敲除 誘導(dǎo)型基因敲除法也是利用Cre Loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ) 利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn) 通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制從而在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的敲除 17 由Cre Loxp系統(tǒng)和誘導(dǎo)系統(tǒng)兩個(gè)部分組成 Loxp轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建成的 基因組中待修飾區(qū)域兩端各攜帶1個(gè)Loxp位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 誘導(dǎo)系統(tǒng)是指所攜帶的Cre基因的表達(dá)或所表達(dá)的Cre的酶活性具有可誘導(dǎo)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 人們可以通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)來對(duì)動(dòng)物基因敲除的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制 以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象 常見的幾種誘導(dǎo)型基因敲除類型有 四環(huán)素誘導(dǎo)型 干擾素誘導(dǎo)型 激素誘導(dǎo)型 腺病毒介導(dǎo)型 18 III 基因編輯技術(shù) ZFN系統(tǒng)TALEN系統(tǒng)CRISPR Cas系統(tǒng) 19 一 ZFN技術(shù)系統(tǒng) 20 ZFN技術(shù)原理 鋅指核酸酶 Zinc fingernucleases ZFN 是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶 利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別特異DNA序列 利用核酸酶切斷靶DNA 鋅指結(jié)構(gòu)中每一個(gè) 螺旋可以特異識(shí)別3 4個(gè)堿基 人工設(shè)計(jì)識(shí)別特異DNA序列的 螺旋采用如上的通用序列 通過改變其中7個(gè)X來實(shí)現(xiàn)識(shí)別不同的三聯(lián)體堿基 TGEK是多個(gè)螺旋間的連接序列 構(gòu)建成對(duì)人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白 ZFN 可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈 21 單個(gè)ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含3 6個(gè)Cys2 His2鋅指結(jié)構(gòu)域 每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域能特異識(shí)別1個(gè)三聯(lián)體堿基 與鋅指蛋白相連接的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的C端96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域 每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN 識(shí)別特定的位點(diǎn) 但2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距6 8bp距離時(shí) 2個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能 在此特異位點(diǎn)產(chǎn)生1個(gè)DNA雙鏈切口 然后利用固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù) 從而達(dá)到對(duì)精確位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾的目的 22 ZFN技術(shù) 鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除 研究人員可以利用ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯 比如基因敲除 已建立有ZFN庫(kù) 識(shí)別多種DNA序列 但還不能達(dá)到識(shí)別任意靶DNA的目的 其應(yīng)用受到一定的限制 23 ZFN技術(shù)已成功應(yīng)用于黑長(zhǎng)尾猴 大鼠 小鼠 中國(guó)倉(cāng)鼠 斑馬魚 果蠅 海膽 家蠶 擬南芥 煙草 玉米 豬 牛 人類iPS細(xì)胞等 此外 該技術(shù)已經(jīng)有用于治療HIV的ZFN藥物進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn) 但是 該技術(shù)制備復(fù)雜 成本昂貴 而且其技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制 24 二 25 嶄新的技術(shù) TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn) 染色體DNA序列的人工編輯修改 點(diǎn) 突變 Silent Missense Nonsense Frameshift 基因敲除 Knockout 片段刪除片段插入目的與用途 生物模型 表達(dá)工具 基因治療 嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn) 26 靶向基因技術(shù) 經(jīng)典方法 自殺質(zhì)粒 同源重組 幾率低 1HReventper106cells 難 飽含希望與失望的技術(shù) ZFN 被Sigma公司壟斷新的里程碑 TALEN 27 TALEN技術(shù) 基于TALEN transcriptionactivator like TAL effectornucleases 類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶 的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具 現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞 酵母 斑馬魚與大鼠等各類研究對(duì)象 技術(shù)原理 表達(dá)一個(gè)重組核酸酶 在靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的作用下 核酸酶識(shí)別靶點(diǎn)核酸序列 并發(fā)揮內(nèi)切酶活性 從而打斷目標(biāo)基因 完成基因敲除的過程 28 1989年植物病原體黃單胞菌屬 Xanthomonasspp avrBs3基因被克隆 2007年發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性 avrBs3 TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列與核酸靶序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系被破譯由34個(gè)aa組成一個(gè)單元模塊 重復(fù)17 18次34個(gè)aa中的第12和13個(gè)氨基酸 RepeatVariantDi residue RVD 對(duì)應(yīng)識(shí)別一個(gè)目標(biāo)堿基 TALEN發(fā)展過程 29 人工構(gòu)建TALE模塊識(shí)別指定核酸序列 102堿基模塊單元 14 18個(gè)重復(fù) 真核表達(dá) 特異識(shí)別指定的14 18個(gè)核酸序列并與之結(jié)合 34氨基酸單元 30 TALEN發(fā)展過程 31 TALEN TALE FOKI 表達(dá)質(zhì)粒對(duì) TALEN基因敲除 X2 TALEN表達(dá)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染 表達(dá)切割靶位點(diǎn) 切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制 nonhomologousend joining NHEJ 由于在此修過程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在 在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體 32 TALEN介導(dǎo)的同源重組 同源重組發(fā)生率升高幾個(gè)數(shù)量級(jí) HR Leftarm Rightarm Leftarm Rightarm 點(diǎn)突變 片段刪除 基因敲入 33 2011年8月 NatureBiotechnology上同時(shí)發(fā)表了用TALEN技術(shù)進(jìn)行基因敲除的4篇研究文章 另加一篇綜述 一篇人類干細(xì)胞 GeneticengineeringofhumanpluripotentcellsusingTALEnucleases 一篇大鼠 KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs 兩篇斑馬魚 TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs 一篇綜述 MoveoverZFN TALEN的最前沿 34 TALEN靶向 基因敲除 技術(shù)基本流程 選擇 確定靶點(diǎn)2 TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建3 TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建4 TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 卵 細(xì)胞 表達(dá)TALEN重組蛋白5 檢測(cè)突變效率 篩選 移碼 突變體 X2 X2 X2 35 靶點(diǎn)的DNA序列特征 相隔17 18bp的兩段14 18bp序列作為靶點(diǎn)參考文獻(xiàn) Cermaketal EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector basedconstructsforDNAtargeting NucleicAcidsResearch 2011 Vol 39 No 12 e82 在線靶點(diǎn)選擇設(shè)計(jì)軟件 https boglab plp iastate edu node add talef off 選擇確定TALE靶點(diǎn) 36 TAL的核酸識(shí)別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸 RVD RVD與A G C T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系 即NI識(shí)別A NG識(shí)別T HD識(shí)別C NN識(shí)別G 非常簡(jiǎn)單明確欲使TALEN特異識(shí)別某一核酸序列 靶點(diǎn) 只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元 14 18個(gè) 串聯(lián)克隆即可 TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建 37 具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng) 38 具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng) 步驟一 靶點(diǎn)識(shí)別單元串聯(lián) 39 步驟二 TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng) 40 將靶點(diǎn)識(shí)別模塊克隆入真核表達(dá)載體 得到Talen質(zhì)粒對(duì)靶點(diǎn)識(shí)別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中 此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列 目前 TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因 因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性 在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰 間隔17堿基 的靶序列 14 18個(gè)堿基 分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建 X2 真核表達(dá)TALEN質(zhì)粒對(duì) 41 步驟三 將TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后 其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點(diǎn)并與靶位點(diǎn)特異結(jié)合 此時(shí) 兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體 發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性 于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間打斷目標(biāo)基因 FOKI內(nèi)切酶打斷靶點(diǎn)區(qū) 42 內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制 nonhomologousend joining NHEJ 由于在此修過程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在 在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體 突變體形成 43 PCR 酶切法利用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)挑選的 位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn) 進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定 當(dāng)左右靶點(diǎn)之間沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL I核酸酶檢測(cè) 經(jīng)驗(yàn)規(guī)律 2 可用 10 很好 TALEN切割效率檢測(cè) 44 TALEN切割效率檢測(cè) 啟動(dòng)子 ABCDEF stop Targetsite DEFHIJK 啟動(dòng)子 ABCDEFHIJK 共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測(cè)質(zhì)粒 TALEN質(zhì)粒1 TALEN質(zhì)粒2 熒光素酶檢測(cè)法 發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究 有文獻(xiàn)表明 發(fā)光倍數(shù)達(dá)1 5至2倍即可有效獲得突變體 45 突變體篩選 有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆PCR 酶切法鑒定PCR測(cè)序確認(rèn) 46 基本工具質(zhì)粒 14 18bp靶點(diǎn)序列 怎樣做TALEN 1單元模塊質(zhì)粒 A G C T共4種2單元模塊質(zhì)粒 4X4 16種TALEN表達(dá)載體 基于PCS2質(zhì)粒2種 47 怎樣做TALEN 48 怎樣做TALEN 49 TALEN技術(shù)成功率影響因素 重組TALEN模塊與靶位點(diǎn)的 親合力 靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)原則來自20個(gè)天然TLAE的統(tǒng)計(jì)規(guī)律細(xì)胞系固有特性K562容易 293中等 MC 10困難細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率不同 293高 HeLa低所期待的目標(biāo)Heterozygous Homozygous Exactpointmutation Selectionmarkerinsertion 50 TALE技術(shù)應(yīng)用范圍 細(xì)菌 尚無(wú)報(bào)道 已另有多種高效靶向技術(shù) 真菌 有報(bào)道 TALE原理可行 植物 TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物 需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞 TALE原理可行 各細(xì)胞系效率不一 斑馬魚 有TALEN基因敲除報(bào)道 尚無(wú)點(diǎn)突變與敲入報(bào)道 小鼠 大鼠 原理肯定可行 但尚無(wú)報(bào)道 技術(shù)太新 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng) TALEN應(yīng)用擴(kuò)展的技術(shù)關(guān)鍵 切實(shí)可靠的表達(dá)系統(tǒng) 高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù) 51 TALEN的植物應(yīng)用 TingLiet al High efficiencyTALEN basedgeneeditingproducesdiseaseresistantrice volume30number5may2012NatureBiotechnology背景水稻病原菌Xanthomonasoryzaepv oryzae Xoo 導(dǎo)致細(xì)菌性白葉枯病 細(xì)菌天然TALEAvrXa7orPthXo3與水稻Os11N3基因啟動(dòng)子結(jié)合 調(diào)控 hijack 此基因上調(diào)表達(dá) 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖份向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn) 便于病原菌利用 策略以TALEN對(duì)細(xì)菌TALE靶點(diǎn)區(qū)做突變 使細(xì)菌TALE無(wú)法與水稻Os11N3基因啟動(dòng)子結(jié)合 結(jié)果突變水稻獲得抵御細(xì)菌感染的能力 52 TALEN與主要類同技術(shù)比較 siRNA優(yōu)于TALEN可瞬時(shí)轉(zhuǎn)染快速觀察效果Knockdown效果確實(shí) 可用于必須基因遜于TALEN瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果短暫不是徹底knockout慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨機(jī)整合ZFN優(yōu)于TALEN經(jīng)驗(yàn)積累多 技術(shù)較成熟遜于TALEN技術(shù)復(fù)雜 難度高 被Sigma公司壟斷靶點(diǎn)序列要求高 難找Off targeting現(xiàn)象嚴(yán)重經(jīng)常有顯著細(xì)胞毒性 53 基因組精密工程 今年來自梅奧醫(yī)學(xué)中心的研究人員第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA 并用合成DNA取代它們 對(duì)斑馬魚基因組部分序列進(jìn)行了定制修改 這種技術(shù)稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 transcriptionactivator likeeffectornucleases TALENs 方法 相比ZFNs和morpholinos TALENs具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì) 它們更便宜 更有效 尤其是以一種開發(fā)活性形式應(yīng)用時(shí) ZFNs只能靶向特異序列 而TALENs有潛力對(duì)任何的DNA序列起作用 Morpholinos的效應(yīng)是短暫的 而TALENs可造成永久性的改變 隨后科學(xué)家們?cè)隗蛤艿绕渌鼊?dòng)物中展開了這方面的研究 證明這種技術(shù)與已證實(shí)的基因靶向技術(shù)一樣有效 國(guó)內(nèi)清華大學(xué)的施一公和顏寧等人也于今年在Science雜志上報(bào)道了TALE特異識(shí)別DNA的分子機(jī)理 這提供了TALE蛋白的改造基礎(chǔ) 極大地拓寬了TALE蛋白在生物技術(shù)應(yīng)用上的前景 54 2012年 TALEN被 科學(xué) 雜質(zhì)評(píng)為十大科學(xué)突破之一 55 新技術(shù)介紹 三 CRISPR Cas系統(tǒng)基因修飾技術(shù)Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats CRISPR CRISPR associated Cas 9 56 Biotechnology RewritingagenomeNature495 50 51 07March2013 doi 10 1038 495050a 57 1CRISPR Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) 1987年 日本大阪大學(xué) OsakaUniversity 在對(duì)E coliK12編碼的堿性磷酸酶 alkalinephosphatase 基因進(jìn)行研究時(shí) 發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段 這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的 而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列 2002年 科學(xué)家將其正式命名為Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats CRISPR 隨著基因組測(cè)序 發(fā)現(xiàn)90 的古細(xì)菌 40 的細(xì)菌基因組中含有CRISPR位點(diǎn) 有的甚至含有2 3個(gè)位點(diǎn) 2013以后 研究者們?cè)诎?science 和 naturebiotechnology 等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR Cas系統(tǒng) 并且已成功在人類 小鼠 斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾 58 CRISPR Cas主要由兩部分組成 識(shí)別 切割 2CRISPR Cas系統(tǒng)的組成 CRISPR Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng) 通過對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別 利用Cas蛋白進(jìn)行切割 從而達(dá)到對(duì)自身的免疫 59 2 1CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) CRISPR clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats CRISPR是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族 廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中 CRISPR位點(diǎn)由一個(gè)前導(dǎo)區(qū) leader 多個(gè)高度保守的重復(fù)序列 repeat 和多個(gè)間隔區(qū) spacer 組成 重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常21 48bp 間隔序列26 72bp spacer 重復(fù)序列具有二重對(duì)稱性 部分間區(qū)序列與某些已知的質(zhì)粒 噬菌體序列相匹配 CRISPR就是通過這些間隔序列 space 與靶基因進(jìn)行識(shí)別 60 61 2 2Cas家族 Cas CRISPRassociated 存在于CRISPR位點(diǎn)附近 是一種雙鏈DNA核酸酶 能在guideRNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割 它與folk酶功能類似 但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用 62 根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同 CRISPR Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型 型 型和 型 型和 型CRISPR Cas免疫系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈 而 型CRISPR Cas免疫系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白來切割DNA雙鏈 目前 型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶 63 CRISPR Cas的基因座結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單 以產(chǎn)膿鏈球菌 StreptococcuspyogenesSF370 的典型Type CRISPR Cas為例 其基因座結(jié)構(gòu)可分別三部分 5 端為tracrRNA基因 中間為一系列Cas蛋白編碼基因 包括Cas9 Cas1 Cas2和Csn2 3 端為CRISPR基因座 由啟動(dòng)子區(qū)域和眾多的間隔序列 spacers 和重復(fù)序列 directrepeats 順序排列組成 3 Type CRISPR Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理 64 crRNAs CRISPR位點(diǎn)的第一個(gè)重復(fù)序列上游有CRISPR前導(dǎo)序列 Leadersequence 該前導(dǎo)序列可以作為啟動(dòng)子 啟動(dòng)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄 多個(gè)研究表明CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPRRNA pre crRNA 然后在Cas蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的RNA單元 這些小RNA即為成熟crRNA 由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成 被命名為CRISPRRNAs crRNAs 這些crRNA和Cas蛋白共同參與CRISPR免疫防御過程 65 tracrRNA 他們發(fā)現(xiàn)tracrRNA trans activatingcrRNA 對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和切割是必需的 tracrRNA的5 端與成熟的crRNA3 端有部分序列 約13bp 能夠配對(duì)進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) 對(duì)維持crRNA與靶點(diǎn)的配對(duì)可能十分重要 其指導(dǎo)RNase 和Cas9完成前體crRNA的成熟 隨后tracrRNA還能與成熟的crRNA的重復(fù)序列配對(duì)形成RNA二聚體 進(jìn)而和Cas9蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體 發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA功能 根據(jù)tracrRNA與crRNA的結(jié)構(gòu)特性 他們將tracrRNA和crRNA表達(dá)為一條嵌合的向?qū)NA guideRNA gRNA 并在體外證明gRNA可以發(fā)揮tracrRNA和crRNA的功能 在目的基因處切割 形成DSBs 該過程是CRISPR Cas對(duì)基因組進(jìn)行編輯的基礎(chǔ) 66 67 Cas9 體外實(shí)驗(yàn)證明Cas9基因是參與CRISPR免疫系統(tǒng)的唯一必需基因 Cas9是由1409個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白 含有2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域 氨基端的RuvC like結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域 HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的模板鏈 切割位點(diǎn)位于原型間隔序列毗鄰基序 Protospaceradjacentmotif PAM 上游3nt處 RuvC like結(jié)構(gòu)域可以對(duì)另一條鏈進(jìn)行切割 切割位點(diǎn)位于PAM上游3 8nt處 在crRNA與tracrRNA形成的雙鏈RNA的指導(dǎo)下 Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割 此外 他們還證明 將RuvC或是HNH活性突變后Cas9只有單鏈切割活性 類似于切口酶 68 到目前為止 雖然CRISPR Cas系統(tǒng)的詳細(xì)作用機(jī)制尚未完全闡明 但已基本明確了該作用機(jī)制的整個(gè)過程 該過程大體分為3個(gè)階段 1 在噬菌體入侵的起始階段 Cas蛋白復(fù)合物靶向并裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列 protospacer protospacer接下來整合到宿主基因組的CRISPR位點(diǎn)的5 端 2 然后這些短的摻入的protospacer被轉(zhuǎn)錄成crRNA 3 最后階段是在Cas蛋白復(fù)合物的參與下 靶向和干擾侵入的噬菌體DNA序列 當(dāng)同種噬菌體再次入侵時(shí) CRISPR的repeats序列截取和保留的入侵噬菌體的某些DNA片段形成spacers spacers會(huì)轉(zhuǎn)錄形成一些小的crRNA 這些crRNA會(huì)與trans activatingcrRNA tracrRNA 形成一種雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu) 以此招募Cas蛋白 crRNA tracrRNA以及Cas蛋白形成復(fù)合體 識(shí)別緊隨protospacer序列后的PAM序列 Cas蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)εccrRNA互補(bǔ)的雙鏈DNA進(jìn)行切割 從而使細(xì)菌具有對(duì)抗同類噬菌體再次入侵的能力 CRISPR基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達(dá)水平很低 當(dāng)外源的質(zhì)粒或是噬菌體入侵宿主菌時(shí)CRISPR的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào) 69 70 71 72 73 噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer 通常protospacer的5 或是3 端延伸幾個(gè)堿基序列很保守 被稱為PAM protospaceradjacentmotifs 它的長(zhǎng)度一般為2 5堿基 一般與protospacer相隔1 4堿基 新間隔序列的獲得可能分為三步 首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM 將臨近PAM的序列作為候選protospacer 然后在CRISPR基因座的5 端合成重復(fù)序列 最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間 74 75 4 CRISPR Cas系統(tǒng)的應(yīng)用 CRISPR Cas系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似 它對(duì)序列的特異性切割主要依賴于crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識(shí)別靶序列上的PAM以及protospacer 根據(jù)CRISPR Cas系統(tǒng)這一特性 將其用于設(shè)計(jì)人工的核酸內(nèi)切酶 engineeredendonuclease EEN 用來對(duì)我們感興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾 三類CRISPR Cas系統(tǒng)中Type 型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對(duì)簡(jiǎn)單 除crRNA和tracrRNA外 只有Cas9一個(gè)蛋白 目前 產(chǎn)膿鏈球菌 StreptococcuspyogenesSF370 的Type 型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶 已經(jīng)在人類細(xì)胞 小鼠 斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾 76 77 4 1CRISPR Cas系統(tǒng)靶向要求 最主要的要求 PAM protospacer adjacentmotif 為NGG 78 在人類基因組中 平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)NGGPAM 79 80 4 2Cas介導(dǎo)編輯模板替換 2013年1月29日在 naturebiotechnology 上發(fā)表的 RNA guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR Cassystems 一文中 作者利用CRISPR Cas系統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向修飾 81 82 4 3Cas介導(dǎo)基因修飾 2013年1月29日在 naturebiotechnology 上發(fā)表的 efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR Cassystem 一文中 作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾 83 84 85 Cas9 sg RNA 86 2013年2月15日在 science 上發(fā)表的 MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR CasSystems 一文中 作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的spacers的crRNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯 4 4Cas介導(dǎo)雙基因修飾 87 88 5CRISPR Cas系統(tǒng)前景分析 這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù) 一項(xiàng)極具有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù) 89 2013年4月12日在 cellstemcell 上發(fā)表的 EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs 一文中 作者利用TALENs和CRISPRs對(duì)同一基因進(jìn)行修飾 效率分別為0 34 和51 79 90 而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來說 CRISPRs比TALENs更容易操作 因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成 而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個(gè)核苷酸就行 91 只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾 Cas蛋白不具特異性 編碼sgRNA的序列不超過