專題5 DNA和蛋白質技術【課題目標】本課題通過嘗試對植物或動物組織中的DNADNA的物理化學性質，理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理。【課題重點與難點】課題重點：DNA的粗提取和鑒定方法。課題難點：DNA的粗提取和鑒定方法。【學問要點】DNA的物理化學性質，尤其是DNA的溶解性；2.二苯胺法鑒定DNA的方法和原理。[學習導航]DNADNA的提取、蛋白質的提取、DNA片段的擴增等，是開展分子生物學爭辯的根本技術。本專題將從根底入手，學習DNA的粗提取、PCR技術和血紅蛋白的提純。學習這些技術，不僅能夠幫助學生初步了解分子生物學的根本試驗方法，而且能夠穩固必修課中學習的有關DNA和蛋白質的理論學問。3個課題相對獨立，沒有嚴格的先后挨次。課題1的操作難度不高，學生比較簡潔獲2的操作難度也不高，但PCR技術的原理是難點，學生要充分利用教材的圖文資料，并且在教師的引導下進展試驗操作。課題3的操作難度比較大，所以學生肯定要在教師的細心指導下完成操作。課題1 DNA的粗提取與鑒定[導學誘思]提取DNA的方法提取生物大分子的根本思路是 。對于DNA的粗提取而言，就是要利用 、 等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。DNA的溶解性DNA這一特點，選擇適當的鹽濃度就能使充分溶解，而使雜質沉淀，或者相反，以到達分別目的。5—1是DNANaCl溶液中的溶解度曲線，請依據曲線圖，思考：①在什么濃度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？②如何通過把握NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于 溶液，但是細胞中的某些蛋白質則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質進一步的分別。DNA對酶、高溫存洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是對 沒有影響。大多數蛋白質不能忍受60—80oC的高溫，而DNA在 以上才會變性。洗滌劑能夠瓦解 ，但對DNA沒有影響。DNA的鑒定 在 條件下，DNA遇 會被染成 色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。試驗設計試驗材料的選取 但凡含有 的生物材料都可以考慮，但是使用 的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的試驗材料：魚卵、豬肝、菜花〔花椰菜、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培育基的大腸桿菌思考：哺乳動物的紅細胞的特點？裂開細胞，獵取含DNA的濾液動物細胞的裂開比較簡潔，以雞血細胞為例，在雞血細胞液中參加肯定量的 ，同時用 攪拌，過濾后收集濾液即可。假照試驗材料是植物細胞，需要先用 溶解細胞膜。例如，提取洋蔥的 DNA時，在切碎的洋蔥中參加肯定的和 ，進展充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。思考：①為什么參加蒸餾水能使雞血細胞裂開？②參加洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？③假設研磨不充分，會對試驗結果產生怎樣的影響?④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？去除濾液中的雜質 閱讀課本的三個方案，思考：為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？方案二與方案三的原理有什么不同？DNA的析出與鑒定將處理后的溶液過濾，參加與濾液體積、冷卻的，靜置，溶液中會消滅 ，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。20ml的試管，各參加物質的量濃度為的NaCl5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各參加4ml的。混合均勻后，將試管置于中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變。操作提示以血液為試驗材料時，每100ml血液中需要參加3g ，防止 。參加洗滌劑后，動作要、，否則簡潔產生大量的泡沫，不利于后續步驟地操作。參加酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要，以免 ，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要 ，否則會影響鑒定的效果。結果分析與評價[疑難點撥]DNANaCl溶液濃度的關系：NaCl0.14mol/L時，隨濃度的上升，DNANaCl溶液濃度高0.14mol/L時，隨濃度上升，DNA的溶解度上升。制備雞血細胞液時，要在穎的雞血中參加檸檬酸鈉的緣由制備雞血細胞液時，要在穎的雞血中參加抗凝劑——檸檬酸鈉，防止血液凝固。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發生反響，生成檸檬酸鈣絡合物，血漿中游離的Ca2+大大削減，血液便不DNA后，要棄出上層清液——血漿。提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是肯定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于試驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；其次步是DNA的釋放和溶解，這一步是試驗成功與否的關鍵，要盡可能使細胞內的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即依據DNA的溶解DNADNA進展鑒定，這是對整個試驗的結果的檢測。在DNA的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時，留意動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5．盛放雞血細胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細胞裂開以后釋放出的DNA，簡潔被玻璃容器吸附，由于細胞內DNADNA就會更少。因此，試驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以削減提取過程的DNA的損失。[典例解析]本試驗中有三次過濾：⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細胞液0.14mol/LNaCl溶液⑶過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次過濾分別為了獲得〔 〕A含核物質的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液B含核物質的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液C含核物質的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案：A解析:用蒸餾水稀釋雞血細胞液，使血細胞的細胞膜、核膜裂開，釋放出核物質，此時過濾只能得到含DNA和其他物質如蛋白質的濾液，這種濾液必需經過試驗中其他步驟得相繼處理，方能得到較純的DNA。DNA0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經過濾留在紗布上。【課本問題答案和提示】〔一〕旁欄思考題為什么參加蒸餾水能使雞血細胞裂開？答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的裂開(細胞膜和核膜的裂開)，從而釋放出DNA。參加洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。假設研磨不充分，會對試驗結果產生怎樣的影響？答：研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響試驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質。5．為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。6．方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分別。〔二〕練習答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是肯定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于試驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；其次步是DNA的釋放和溶解，這一步是試驗成功與否的關鍵，要盡可能使細胞內的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即依據DNA的DNADNA進展鑒定，這是對整個試驗的結果的檢測。答：提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是由于，與DNA相比，蛋白質對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很簡潔失活；并且蛋白質的空間構造多種多樣，理化性質各不一樣，使得蛋白質的提取沒有一種統一的方法，只能依據特定蛋白質的特性摸索提取的條件，設計特定的方法。[課堂演練]一、選擇題〔10個〕在爭辯DNA的基因樣本前采集來的血樣需要蛋白水解酶處理然后用有機溶劑除去蛋白質用蛋白水解酶處理血樣的目的是〔D 〕A.除去血漿中的蛋白質 B.除去染色體上的蛋白質 C.除去血細胞外表的蛋白質D.除去血細胞中的全部的蛋白質，使DNA釋放，便于進一步提純與析出DNA粘稠物有關的表達，不正確的選項是〔C 〕操作時緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度在操作A時，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整加蒸餾水可同時降低DNA和蛋白質的溶解度，兩者均可析出D.當絲狀粘稠物不再增加時，此時NaCl的濃度相當于0.14mol/L3．洗滌劑能夠瓦解〔B ，但對DNA沒有影響。A.細胞壁 B.細胞膜 C.細胞核 D.細胞質4．在沸水浴的條件下，DNA遇〔D 〕會被染成藍色。A.斐林試劑 B.蘇丹Ⅲ染液 C.雙縮脲試劑 D.二苯胺5．在DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是〔B 〕A.不易裂開 B.削減提取過程中DNA的損失C.增加DNA的含量 6．以下操作中，對DNA的提取量影響最小的是〔B 〕A.使雞血細胞在蒸餾水中充分裂開，放出DNA等核物質B.攪拌時，要使用玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌C.在“析出DNA粘稠物”時，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E在DNA的溶解和再溶解時，要充分攪拌DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的〔D ，靜置—3mi，溶液中會消滅白絲狀物。A.0．9%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液C.質量分數15%的HCl D.體積分數為95%的酒精溶液以血液為試驗材料時，需要向血液中參加〔C ，防止血液凝固。醋酸鈉 B.龍膽紫 C.檸檬酸鈉 D.醋酸洋紅在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷參加蒸餾水的目的是〔C 〕加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質的速度 C.削減DNA的溶解度加快DNA析出 D.減小雜質的溶解度，加快雜質的析出去除濾液中的雜質時，直接在濾液中參加嫩肉粉，利用嫩肉粉中的〔C 〕分解蛋白質。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 二、非選擇題〔3個〕提取雞血中DNA時，要除去血液中的上清液，這是由于什么？NA提取雞血中的DNA時，要除去血液中的上清液。填寫本試驗完成以下試驗操作時所用試劑。⑴提取雞血細胞中核物質⑵溶解核內DNA：2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸提取雜質較少的DNA白色乳狀絲狀物⑹DNA的鑒定2mol/LNaCl2mol/LNaCl95的酒精⑹二苯胺關于DNA緣由是什么？請答復以下問題：⑴雞血細胞中紅細胞 ，家雞屬于鳥類，陳代謝旺盛，因而血液中 細胞樹木較多，可以供給豐富的 。⑵試驗前由教師制備血細胞液供同學們做試驗材料，而不用雞全血，主要緣由是。⑶生活在牧區的人們，采集牛、羊和馬血比較便利，假設他們按試驗要求完成試驗步驟后，結果是 ，這是由于這些動物和人一樣，成熟的紅細胞中 ，但假設改用動物肝臟做試驗材料，試驗能順當進展。這是由于 。⑷假設選用動物肝臟做試驗材料，在提取之前，最好增加 程序，使組織細胞更易分別。答案：⑴含細胞核；紅DNA ⑵雞血細胞液DNA相對含量⑶很難提取DN；無細胞核；肝細胞有細胞核⑷研磨【學問拓展】二苯胺鑒定DNA的化學原理DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ(溶液呈淺藍色)。鑒定時溶液藍色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關。研磨液中幾種藥品的作用Tris/HCl:供給緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩定態〔Tris為三羥甲基氨基甲烷。EDT〔乙二胺四乙酸二鈉：是DNA酶的抑制劑，可以防止細胞裂開后DNA酶降解DNSD〔十二烷基磺酸鈉：可以使蛋白質變性，與DNA分別。【教學反思】課題2 多聚酶鏈式反響擴增DNA片段【課題目標】本課題通過嘗試PCR〔DNA多聚酶鏈式反響〕技術的根本操作，使學生體驗PCR這一常規的分子生物學試驗方法，理解PCRPCR【課題重點與難點】課題重點：PCR的原理和PCR課題難點：PCR參與的組分解旋酶DNA母鏈DNA復制中的作用合成子鏈的原料參與的組分解旋酶DNA母鏈DNA復制中的作用合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將DNA的羥基末端稱為，而磷酸基團的末端稱為。DNA聚合酶不能開頭合成DNA，而只能 ，因此，DNA復制需要引物。DNA的合成方向總是 。在DNA的復制過程中，復制的前提是 。在體外可通過把握來實現。在 的溫度范圍內，DNA的雙螺旋構造將解體，雙鏈分開，這個過程稱為 。PCR利用了DNA的 原理，通過把握溫度來把握雙鏈的解聚與結合。由于PCR過程的溫度高，導致DNA聚合酶失活，后來 的DNA聚合酶的覺察和應用，大大增加了PCR的效率。PCR反響需要在肯定的緩沖溶液中供給： ， ，， ，同時通過把握溫度使DNA復制在體外反復進展。PCR的反響過程PCR一般要經受循環，每次循環可以分為、和三步。從其次輪循環開頭，上一次循環的產物也作為模板參與反響，并且由 延長而成的DNA單鏈會與結合，進展DNA的延長，這樣，DNA聚合酶只能，使這段固定長度的序列成指數擴增。試驗操作在試驗室中，做PCR通常使用 ，它是一種薄壁塑料管。具體操作時，用微量移液器按PCR反響體系的配方在中依次參加各組分再參照下表的設置設計好PCR儀的循環程序即可。操作提示為避開外源DNA等因素的污染，PCR試驗中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使用前必需進展 。PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢溶化。在微量離心管中添加反響成分時，移液管上的槍頭要 。[疑難點撥]PCR技術簡介PCR是一種體外快速擴增DNADNA上百萬份的DNADNA含量太低而難以對樣品進展分析爭辯的問題，被廣泛的應用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等各方面。細胞內參與DNA復制的各種組成成分及其作用①解旋酶：翻開DNA雙鏈②DNA母鏈：供給DNA復制的模板③4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3端開頭連接脫氧核苷酸〔引物是一小段DNA或RNADNA母鏈的一段堿基序列互補配對。用于PCR20—30個核苷酸〕DNA的合成方向DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將DNA3，端，而磷酸基團的末端稱為5，DNA聚合酶不能從頭開頭合成DNA3，端延長DNADNA復制需要引物。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA3，端開頭延長DNA鏈，DNA5，3，端延長。PCR的反響過程PCR〔90oCDNA解聚為單鏈、復性〔溫度下降到50oC左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合〕和延長〔溫度上升到72oC左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，依據堿基互補配對原則合成的DNA鏈〕三步。從其次輪循環開頭，上一次循環的產物也作為模板參與反響，并且由引物Ⅰ延長而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進展DNA的延長，這樣，DNA聚合酶只能特異的復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數擴增。PCR技術與DNA的復制PCRDNA復制在體外反復進展。PCRDNA復制，所以有關PCR反響的題目與DNA復制的原理一樣，計算方法也大體一樣。例如：PCR反響中的目的2nnDNA30次循環后反響物中大約有10〔230〕[典例解析]]一個由15N標記的DNA分子，放在沒有標記的環境中培育，利用PCR循環5次后標記的DNA分子總數的〔 〕A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25答案：CDNA分子利用PCR5次后產生的DNA2nDNA的復制是半保存復制，其特點是：形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是形成的子15N標記的DNA分子復制后，其標記的兩條鏈就分別進入兩個子代DNA分子中，這樣兩個子代DNA分子被標記了。以后均是在沒有標記的環境中培育，不管經過多少次復制，最DNAnDNA2/2n,即1/2n-1。【課本問題答案和提示】練習提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR2nnDNA3010〔2n=230=1073741824)。提示：PCR引物是依據需要擴增的目標DNA的堿基序列來設計的。引物的設計需要豐富的分子生物學試驗閱歷，感興趣的學生可以參考《分子克隆試驗指南》〔見本專題參考書目〕，書中有詳盡的論述。【課堂演練】一．選擇題〔10個〕DNA分子復制時，解旋的兩條鏈中〔C 〕A僅一條作為復制模板B兩條鏈作為模板并復制出兩個不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復制出兩個一樣的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重結合為原來的雙螺旋分子，兩條鏈結合成一個全的DNA分子以下關于DNA復制過程的正確挨次是〔D〕①互補堿基對之間氫鍵斷裂②互補堿基對之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進展堿基互補配對⑤子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀構造A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤3.以下各項過程中，遵循“堿基互補配對原則”的有〔A 〕①DNA復制②RNA復制③轉錄④翻譯⑤逆轉錄A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤4.試驗室內模擬生物體DNA的復制必需的一組條件是〔D 〕①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧利用PCR技術，把一個雙鏈DNA分子當作第一代經過3次循環，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？〔A 〕A 2 B 4 C 8 D 16，關于DNA分子的表達中，正確的選項是〔C〕A.DNA的兩條鏈是極性一樣，同向平行 B.DNA的兩條鏈是極性一樣，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈是極性不同，同向平行假設PCR反響中，只有一個DNA的片段作為模板，請計算在30次循環后，反響物中大約有多少這樣的DNA片段〔B 〕A 215 B 230 C 260 D 231DNA的合成方向總是〔C 〕延長。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端要使PCR反響在體外的條件下順當地進展，需要嚴格的把握〔C 〕A氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D大氣的濕度DNA分子經PCR反響循環一次后，合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應與〔 〕A模板母鏈一樣 B非模板母鏈一樣 C兩條模板母鏈一樣D兩條模板母鏈都不一樣二．非選擇題〔2個〕PCR技術是把某一DNA片段在試驗條件下，合成許很多多一樣片段的一種方法，利用這種技能快速而特異的擴增任何要求的目的基因或者DNA分子片段到這種技術。請結合有關學問，答復有關此技術的一些問題：⑴PCR技術能把某一DNA片段進展擴增，依據的原理是：⑵在試驗條件下，DNA分子進展擴增，除了所要擴增的DNA片段處，還需要 和 、 等條件。DNA16035個，假設讓該DNA分子擴增三次〔即復制三次〕至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數目分別是 和 個。答案：⑴DNADNA分子中堿基的互補配對⑵四種脫氧核苷酸、能量、酶⑶245、31515NDNA15N標記。然后將被15N標記的大腸桿菌作為親代轉到一般培育基中，生殖兩代。親代、第一代、其次代大腸桿菌DNA的狀況如下圖。⑴第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息完全一樣的緣由是 。⑵假設將其次代大腸桿菌的DNA分子總量作為整體1，其中，帶有15N的其次代大腸桿菌DNA分子約占總量的 %。⑶假設將其次代大腸桿菌的DNA115N標記的其次代大腸桿菌的DNA含量〔脫氧核苷酸單鏈〕約占總量的 %1N標記的DNA雙鏈的每條鏈為模板50⑶25【參考資料】瓊脂糖凝膠濃度與DNA分別范圍的關系凝膠濃度要依據DNA16srRNADNA15004-11％〔1g/100mL，下同〕的凝膠濃度。4-1DNA0.30.60.70.91.21.512.0

kb)5～601～200.8～100.5～70.9～60.2～30.1～2核酸電泳緩沖液核酸電泳緩沖液有三種，分別是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三種緩沖液中：TBETPE緩沖液容量高，對DNA的分別效果好，但TPEDNA沉淀。TAE液的緩沖容量低，價格較廉價。本試驗選用的是TBE緩沖液。緩沖液EDTADNAPCR10倍濃縮的TBETris 108g EDTA9.3g硼酸 55g1000mLpH8.0～8.210倍。核酸電泳的指示劑與染色劑核酸電泳常用的指示劑是溴酚藍，溴酚藍在堿性條件下呈藍紫色。指示劑一般與蔗糖、甘油或400DNA內；能夠在電泳中形成肉眼可見的藍紫色指示帶，從而幫助推測核酸電泳的速度和位置；能夠使樣品呈現藍紫色，使加樣操作更便利。核酸電泳后，需要染色才能在紫外線下觀看到帶型。最常用的染色方法是溴化乙錠染色法。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，有劇毒，因此操作時要格外留神。EB可嵌入DNA在紫外線激發下，能發出紅色熒光。染色的方法有兩種。一種是在凝膠電泳液中參加EB，使其終濃0.5μg/mL0.5μg/mLEB10～15min。當凝膠染色過深時，可以將凝膠放入蒸餾水中浸泡30minPCRPCRTaqDNA活力不夠或其活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統的建立欠妥當；循環次數不夠；等等。當試驗中消滅假陰性的狀況時，應首先在原來擴增的產物中再參加TaqDNA5～10TaqDNA用活力高、質量好的酶。同時，在提取DNA模板時，應特別留意避開提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。盡管TaqDNAPCRDNA3′端與靶基因互補。PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成非目標DNA片段的大量擴增，因此模板DNA的污染是PCR假陽性結果的主要緣由。此外，樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽性結果。為了避開因污染而造成的假陽性結果，PCR操作時要留意做到：隔離操作區，分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性吸頭等【教學反思】課題3 血紅蛋白的提取和分別【課題目標】子的根本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分別生物大分子的根本原理，為今后學習運用這些技術打下根底。【課題重點與難點】課題重點：凝膠色譜法的原理和方法。課題難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。【導學誘思】凝膠色譜法路程，移動速度；而相對分子質量的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在移動，路程，移動速度。相對分子質量不同的蛋白質分子因凝膠色譜法也稱做 ，是依據 分別蛋白質的有效方法。凝膠實際上是一些由 構成的多孔球體，在小球體內部有很多貫穿的通道，相對分子質量路程，移動速度；而相對分子質量的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在移動，路程，移動速度。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分別。緩沖溶液緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內進展的各種生物化學反響都是在一定的pH下進展的，例如：血漿的pH是 ，要在試驗條件下準確模擬生物體內的過程，必需保持體外的pH與體內的根本全都。電泳電泳是指 很多重要的生物大分子如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在肯定的pH下，這些基團會帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各分子以及分子本身的、的不同，使帶電分子產生不同的 ，從而實現樣品中各種分子的分別。兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質分子量時通常使用 。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于以及 等因素。蛋白質的提取和分別蛋白質的提取和分別一般分為四步： 、 、 和 。樣品處理血液由 和 組成，其中紅細胞最多。紅細胞具有的特點。紅細胞中有一種格外重要的蛋白質 ，其作用是，血紅蛋白有個肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈圍繞一個，磁基團可攜帶 。血紅蛋白因含有呈現紅色。紅細胞的洗滌洗滌紅細胞的目的是 ，采集的血樣要準時承受 分別紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透亮的，將下層暗紅色的倒入燒杯，再參加 ，緩慢攪拌，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至 ，說明紅細胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放在和作用下，紅細胞裂開釋放出血紅蛋白。分別血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透亮的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透亮液體，這是 ，第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透亮液體。透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入中將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的中，透析12h。透析可以去除樣品中 的雜質，或用于更換樣品的。凝膠色譜操作第一步要制作 ，其次步要 ，由于 ，所以裝柱前需要依據色譜柱的內體積計算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時，不得有存在。由于氣泡會 ，降低分別效果。第三步是。【疑難點撥】1．凝膠色譜法分別蛋白質的原理凝膠色譜法也稱為安排色譜法，它是依據分子量的大小分別蛋白質的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數是由多糖類化合物構成，小球體內部有很多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時，各分子在色譜柱內進展兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規章的集中運動，相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較簡潔進入相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最終流出，這種現象又叫分子篩現象。此外，凝膠本身具有三維網狀構造，相對分子質量大的分子通過這種網狀構造上的空襲時阻力大，而相對分子質量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得分別。2．與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進展蛋白質的分別的意義哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分別時可以通過觀看顏色來推斷什么時候應當收集脫液。這使血紅蛋白的分別過程格外直觀，大大簡化了試驗操作。電泳的作用及其原理蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的用待分別樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、外形等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而到達對樣品進展分別、鑒定或提純的目的。【典例解析】用凝膠色譜法分別蛋白質時，分子量大的蛋白質〔D 〕A路程較長，移動速度較慢B路程較長，移動速度較快C路程較短，移動速度較慢D路程較短，移動速度較快解析：在小球體內部有很多貫穿的通道，當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質簡潔進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。【課本問題答案和提示】〔一〕旁欄思考題你能從凝膠色譜的分別原理分析為什么凝膠的裝填要嚴密、均勻嗎？答：凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體內部有很多貫穿的通道。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較簡潔進入凝膠內的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最終流出，從而使各種相對分子質量不同的分子得以分別。假設凝膠裝填得不夠嚴密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流淌次序，影響分別的效果。〔二〕練習答：凝膠色譜法也稱為安排色譜法，它是依據分子量的大小分別蛋白質的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數是由多糖類化合物構成，小球體內部有很多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時，各分子在色譜柱內進展兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規章的集中運動。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較簡潔進入凝膠內的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最終流出，這種現象又叫分子篩現象。此外，凝膠本身具有三維網狀構造，相對分子質量大的分子通過這種網狀構造上的空隙時阻力大，而相對分子質量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得分別。pH發生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物〔緩沖劑〕溶解于水中制得，調整緩沖劑的配比就可制得不同pH緩沖溶液的作用是維持反響體系的pH不變。在生物體內進展的各種生物化學過程都是在準確的pH下進展的，受到氫離子濃度的嚴風格控。為了在試驗室條件下準確地模擬生物體內的自然環境，就必需保持體外生物化學反響過程有與體內過程完全一樣的pH。答：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程。很多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待分別樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、外形等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而到達對樣品進展分別、鑒定或提純的目的。答：血紅蛋白提取和分別的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分別、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分別；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最終經聚丙烯酰胺凝膠電泳進展純度鑒定。答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分別時可以通過觀看顏色來推斷什么時候應當收集洗脫液。這使血紅蛋白的分別過程格外直觀，大大簡化了試驗操作。[課堂演練]一．選擇題1．凝膠色譜法是依據〔B 〕分別蛋白質的有效方法。A分子的大小 B相對分子質量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2．緩沖液的作用是：在肯定范圍內，抵抗外界的影響來維持〔B 〕根本不變。A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷〔B〕的電極移動。A一樣 B相反 C相對 D相向4.哺乳動物和人的成熟的紅細胞中的〔A 〕與氧氣的運輸有關。A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動蛋白 D肌球蛋白5．血液由血漿和各種血細胞組成，其中〔C 〕的含量最多。A白細胞 B血小板 C紅細胞 D淋巴細胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預先參加抗凝血劑〔D 。A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是〔C 〕A無色透亮的甲苯層 B脂溶性物質的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液D其他雜質的暗紅色沉淀物二．非選擇題電泳利用了待分別樣品中各種分子 以及 、 的不同，使帶電分子產生不同的遷移速率，從而實現樣品中各種分子的分別。答案：帶電性質的差異；分子本身的大小；外形的不同你能描述血紅蛋白分別的完整過程嗎？答案：血紅蛋白提取和分別的程序可分為四大步。包括：樣品處理、粗分別、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；在經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分別；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最終經聚丙烯酰胺凝膠電泳進展純度鑒定。參考資料聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度試劑的配制N,N29%〔29g/100mL，下同〕的丙烯1N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。由于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中會分別緩慢轉變為丙烯酸和雙丙烯酸，這一反響是由光或堿催化的。因此在每次使用前，應核實溶液的pH不7.0；并且應將配制好的溶液置于棕色瓶中，室溫貯存，每隔幾個月須重配制。十二烷基硫酸鈉〔SDS〕用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。用于制備分別膠和濃縮膠的Tris緩沖液1.5mol/L、pH8.8Tris〔分別膠緩沖液〕；1mol/L、pH6.8Tris〔濃縮膠緩沖液〕。TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)TEMED胺與雙丙烯酰胺的聚合。過硫酸銨用去離子水配制10%的過硫酸銨溶液。過硫酸銨供給驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制穎液。Tris—甘氨酸電泳緩沖液25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1SDS。樣品處理液50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2SDS，0.1%的溴酚藍，10%的甘油。染色液0.1%的考馬斯亮藍R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脫色液1010%的冰醋酸。必需在通風櫥內或通風處進展。TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進展電泳操作時肯定依據試驗要求和步驟，在教師的指導下完成。操作時要戴好一次性手套。電泳依據廠家說明書安裝電泳用的玻璃板。SDS4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris2.5mL，10SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，0.5cm)，再在膠液面上留神注入一層水〔約高2～3mm〕，以阻擋氧氣進入凝膠溶液。分別膠聚合完全后〔30min〕，傾出掩蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。SDS2.7mL，300.67mL，1.0mol、pH6.8Tris0.5mL，10SDS0.041mL，100.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分別膠上，并馬上在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個操作過程應留意避開氣泡的產生。然后再補加濃縮膠溶液，使其布滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。1∶1體積比參加樣品處理液，1003min，以使蛋白質變性。濃縮膠聚合完全后〔30min〕，留神移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各參加Tris—甘氨酸電泳緩沖液。必需設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。按挨次加樣，加樣量通常為10～25μL。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞裂開后(即進展凝膠色譜分別之前)的樣品和凝膠色譜分別之后的樣品。將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當染料前沿進入分別膠后，把電壓15V/cm，連續電泳直至溴酚藍到達分別膠底部上方約1cm從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔〔第一槽〕凝膠下部切去一角，以標注凝膠的方位。將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍染色液中染色1～2h3～10h，其間需屢次更換脫色液至背景清楚。脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內使其不會降低染色強度。為保存永久性記錄，可對凝膠進展拍照，或將凝膠枯燥成膠片。通過本試驗的電泳圖譜，可以觀察提取的血紅蛋白的純度并不是很高。【教學反思】專題學問歸納根底學問：提取DNA的方法試驗材料的選取試驗設計裂開細胞，獵取含DNA的濾液去除濾液中的雜質DNA的粗提取與鑒定DNA的析出與鑒定以血液為材料要防止血液凝固DNA和蛋白質技術操作提示棒攪拌時，動作要輕緩二苯胺試劑要現配現用結果分析與評價課題延長PCR原理根底學問 PCR的反響過程多聚酶鏈式反 試驗操作應擴增DNA 操作提示片段 結果分析與評價課題延長凝膠色譜法血紅蛋白的提根底學問緩沖溶液取和分別電泳樣品處理試驗操作凝膠色譜操作SDS—聚丙烯酰凝膠電泳紅細胞的洗滌試驗操作色譜主填料的處理凝膠色譜柱的裝填蛋白質的分別結果分析與評價課題延長專題學問檢測一、選擇題DNA的溶解度最低時，NaCl的物質的量濃度為〔C〕A.2mol/L B.0.1mol/L C.0.14mol/L D.0.015mol/L2．DNA不溶解于〔C 〕A.NaCl溶液 B.KCl溶液 C.酒精溶液 D.MgCl2溶液3．鑒定DNA的試劑是〔D 〕A.斐林試劑 B蘇丹Ⅲ染液 C.雙縮脲試劑 D.二苯胺試劑4．在向溶解DNA得NaCl溶液中，不斷參加蒸餾水的目的是〔C 〕A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質的速度C.減小DNA的溶解度加快DNA析出 D.減小雜質的溶解度，加快雜質的析出在DNA的粗提取過程中，初步析出DNA和提取較純潔的DNA所用的藥品的濃度及其名稱分別是〔B 〕①0.1g/ml檸檬酸鈉溶液②2mol/LNaCl溶液③0.14mol/LNaCl溶液④體積分數為95%的酒精溶液⑤0.015mol/LNaCl溶液⑥0.04mol/LNaCl溶液A.①③⑤ B.③④ C.②④ D.②③④關于DNA的粗提取與鑒定試驗的表達哪項是錯誤的〔C 〕離心沉淀的血細胞中加水是為了提取DNANaCl2mol/L時，DNA溶解向溶解的DNA燒杯中加蒸餾水是漂洗DNAD.離心后除去血液中的上清液是為了除去雜質以下關于試驗現象的正確描述是〔C 〕向盛有果糖溶液的試管中參加斐林試劑，產生轉紅色沉淀紙層析法分別葉綠體中的色素時，濾紙條上最寬的色素帶呈黃綠色C.DNA的粗提取中，其次次參加蒸餾水并攪拌，能析出含DNA的黏稠物D.同一葉片受SO2危害的挨次是先葉柄后葉片關于